低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPAH）是临床常见的病理生理过程，也是慢性阻塞性肺疾病及慢性肺源性心脏病发生发展的重要病理环节，主要表现为急性低氧性肺血管收缩和慢性低氧性肺血管重塑。在低氧引起的肺血管重塑过程中，肺动脉平滑肌细胞（ pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMC）的增殖发挥重要作用。研究表明，钙敏感受体（Ca2+-sensing receptor，CaSR）参与了HPAH的发生与发展，但是具体机制不明。另外有文献报道，低氧时肺血管平滑肌经典瞬时受体电位蛋白（transient receptor potential canonical protein，TRPC）表达上调与肺血管重塑密切相关。在人乳腺癌细胞上的研究发现，CaSR激活后可引起细胞增殖和TRPC-1的表达上调；而在人主动脉平滑肌细胞上的研究却发现，CaSR激活后引起的钙内流及细胞增殖则是通过TRPC-6编码的钙通道完成的。那么，在低氧条件下，CaSR激活引起的大鼠远端PASMC增殖是否也需要TRPC参与及TRPC参与的具体成员目前并不清楚。　　空气颗粒物（particulate matter，PM）是指分散在空气中的固态或液态颗粒状物质，其中空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物称为PM2.5，由于其粒径小，且富集大部分有害元素和化合物，能侵入下呼吸道并在肺泡中沉积，甚至通过肺泡进入血液循环，对机体产生更为广泛而严重的损害。流行病学研究表明，PM2.5暴露与支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病及心力衰竭、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、高血压等心血管疾病密切相关。国外研究表明，由柴油机废气形成的 PM2.5的急性暴露可导致人肺血管阻力增加并使肺外周阻力血管张力下降，提示PM2.5暴露可能参与肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）发病，但其具体机制尚不清楚。那么，PM2.5能否促进 PASMC的增殖呢？在慢性低氧条件下PM2.5又会对PASMC增殖产生怎样的影响呢？以及其可能的机制是什么呢？我们将通过收集TRPM2.5（traffic related particulate matter2.5，TRPM2.5）对这些问题进行研究。　　目的:　　本研究通过原代培养大鼠远端PASMC观察慢性低氧与TRPM2.5对PASMC增殖的影响，研究CaSR和TRPC在慢性低氧与TRPM2.5引起的PASMC增殖中的作用以及 CaSR与 TRPC的调控关系，明确慢性低氧与 TRPM2.5通过CaSR-TRPC通路介导PASMC增殖的分子机制。　　方法:　　一、慢性低氧对大鼠远端PASMC增殖的影响及机制：　　1、大鼠远端PASMC的原代培养及鉴定：　　体式显微镜下利用显微镊和显微剪分离大鼠远端肺动脉（4级分支以下），运用胶原酶消化法消化、分离、培养原代PASMC，通过血管平滑肌细胞形态学、平滑肌α肌动蛋白、波形蛋白以及八因子特征性免疫荧光染色来鉴定细胞的纯度。　　2、慢性低氧对大鼠远端PASMC增殖的影响：　　分别采用CCK-8、细胞计数以及EdU法观察慢性低氧（60h，4％O2）对大鼠远端PASMC的细胞活力、细胞计数及处于S期细胞比例的影响。　　3、慢性低氧对大鼠远端PASMC CaSR、TRPC1、TRPC4和TRPC6表达的影响：　　采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative PCR，Q-PCR）、蛋白免疫印迹（western-blot）方法观察慢性低氧（60h，4%O2）对大鼠远端PASMC CaSR、TRPC1、TRPC4、TRPC6 mRNA和蛋白表达的影响。　　4、CaSR激动剂及阻滞剂对慢性低氧条件下PASMC CaSR表达及PASMC增殖的影响：　　慢性低氧（60h，4%O2）条件下，采用Q-PCR及western-blot方法检测CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）及阻滞剂（2μM NPS2143、10μM NPS2390）对大鼠远端PASMC CaSR mRNA和蛋白表达的影响；并采用CCK-8、细胞计数以及EdU法观察CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）及阻滞剂（2μM NPS2143、10μM NPS2390）对PASMC的细胞活力、细胞计数及处于S期细胞比例的影响。　　5、慢性低氧条件下，大鼠远端PASMC CaSR与TRPC1、TRPC6的调控关系及对PASMC增殖的影响：　　（1）慢性低氧（60h，4%O2）条件下，采用Q-PCR及western-blot方法检测CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）及CaSR特异性siRNA（siCaSR）对大鼠远端PASMC TRPC1和TRPC6 mRNA和蛋白表达的影响；并采用CCK-8、细胞计数以及EdU法观察CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）及siCaSR对PASMC的细胞活力、细胞计数及处于S期细胞比例的影响。　　（2）慢性低氧（60h，4%O2）条件下，采用Q-PCR及western-blot方法检测TRPC1、TRPC6特异性siRNA（siTRPC1、siTRPC6）对大鼠远端PASMC CaSR mRNA和蛋白表达的影响，并采用CCK-8、细胞计数以及EdU法观察siTRPC1、siTRPC6对PASMC增殖的影响。　　二、慢性低氧条件下TRPM2.5对大鼠远端PASMC增殖的影响及机制：　　1、不同浓度的TRPM2.5对PASMC增殖的影响：　　采集自广东省广州市东风西路道路旁3月至4月大气TRPM2.5，使用装配有PM2.5切割头的大流量采样器，利用DMSO溶液及水浴超声波振荡提取PM2.5，用 DMSO倍比稀释至所需浓度（DMSO终浓度均不超过0.5%），用稀释后的PM2.5（浓度分别为0、0.12、0.6、3、15μg/ml）处理PASMC，常氧（21%O2）条件下培养60h，CCK-8法检测TRPM2.5对PASMC增殖的影响。　　2、慢性低氧条件下，TRPM2.5对PASMC增殖的影响：　　慢性低氧（4% O2）条件下，3μg/ml的TRPM2.5处理大鼠远端PASMC60h后，采用CCK-8、细胞计数、EdU法观察PASMC的细胞活力、细胞计数及处于S期细胞比例的变化。　　3、慢性低氧条件下，TRPM2.5对大鼠远端PASMC CaSR、TRPC1、TRPC4以及TRPC6表达的影响：　　慢性低氧条件下（4%O2），3μg/ml的TRPM2.5处理大鼠远端PASMC60h后，采用Q-PCR及western-blot方法检测大鼠远端PASMC CaSR、TRPC1、TRPC4以及TRPC6 mRNA和蛋白表达的变化。　　4、慢性低氧条件下与 TRPM2.5作用下，CaSR激动剂及阻滞剂对 PASMC CaSR表达及PASMC增殖的影响：　　慢性低氧（4% O2）条件下，3μg/ml的TRPM2.5孵育大鼠远端PASMC，加用CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）及阻滞剂（2μM NPS2143、10μM NPS2390）作用细胞60h后，采用Q-PCR及western-blot方法检测大鼠远端PASMC CaSR的表达变化，并采用CCK-8、细胞计数以及EdU法观察PASMC的细胞活力、细胞计数及处于S期细胞比例的变化。　　结果:　　一、慢性低氧对大鼠远端PASMC增殖的影响及机制：　　1、原代培养的大鼠远端 PASMC具有典型的血管平滑肌细胞形态学特征，平滑肌α肌动蛋白免疫荧光染色呈阳性反应，但对波形蛋白以及八因子免疫荧光染色呈阴性反应，细胞纯度达98%以上。　　2、慢性低氧（60h，4% O2）条件下，低氧组PASMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高。　　3、慢性低氧（60h，4%O2）条件下，大鼠远端PASMC CaSR、TRPC1、TRPC6 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著升高，而TRPC4的mRNA和蛋白表达水平与对照组比较则无差异。　　4、慢性低氧（4% O2）条件下，CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）作用细胞60h后，大鼠远端PASMC的CaSR mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著升高，且大鼠远端PASMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高；相反，CaSR阻滞剂（2μM NPS2143、10μM NPS2390）作用细胞60h后，大鼠远端PASMC的CaSR mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著下降，且大鼠远端PASMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著下降。　　5、慢性低氧（4% O2）条件下，CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）作用细胞60h后，大鼠远端PASMC的TRPC1和TRPC6 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著升高，但siCaSR作用细胞60h后，大鼠远端TRPC1和TRPC6 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著下降，且大鼠远端PASMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著下降。　　6、慢性低氧条件下（4%O2），siTRPC1和siTRPC6作用细胞60h后，大鼠远端PASMC CaSR的mRNA和蛋白表达水平与对照组比较则无差异，但大鼠远端PASMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著下降。　　二、慢性低氧条件下TRPM2.5对大鼠远端PASMC增殖的影响及机制：　　1、CCK-8结果显示：常氧（21%O2）条件下，不同浓度的TRPM2.5（0～15μg/mL）处理大鼠远端PASMC60h后，TRPM2.5能够促进大鼠远端PASMC增殖，并且在一定的浓度范围内（0～3μg/mL）呈浓度依赖性。　　2、常氧（21% O2）条件下，3μg/mL的TRPM2.5处理大鼠远端PASMC60h后，大鼠远端PASMC的细胞活力、细胞数及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高，而慢性低氧（4% O2）条件下，3μg/mL的 TRPM2.5处理大鼠远端PASMC60h后，PASMC的细胞活力、细胞数及处于S期的细胞比例与对照组比较则进一步升高。　　3、常氧（21% O2）条件下，3μg/mL的TRPM2.5处理大鼠远端PASMC60h后，大鼠远端PASMC的CaSR、TRPC1和TRPC6 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著升高；而慢性低氧（4%O2）条件下，3μg/mL的TRPM2.5处理大鼠远端PASMC60h后，PASMC的CaSR、TRPC1和TRPC6 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著升高，但TRPC4 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较则无差异。　　4、慢性低氧（4%O2）条件下，以3μg/mL的TRPM2.5孵育大鼠远端PASMC，加用CaSR激动剂（2μM精胺、2μM R568）作用细胞60h后，大鼠远端PASMC的CaSR mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著升高，且大鼠远端PASMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高。相反，加用CaSR阻滞剂（2μM NPS2143、10μM NPS2390）作用细胞60h后，大鼠远端PASMC的CaSR mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均显著下降，且大鼠远端PASMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著下降。　　结论:　　1、慢性低氧通过上调大鼠远端 PASMC的 CaSR的表达而增强 TRPC1和TRPC6的表达，进而导致 PASMC的增殖；　　2、TRPM2.5能够促进大鼠远端PASMC增殖，且在一定的浓度范围内呈浓度依赖性；而慢性低氧条件下TRPM2.5促进大鼠PASMC增殖的作用进一步增强；　　3、慢性低氧条件下，TRPM2.5可上调大鼠远端PASMC的CaSR、TRPC1和TRPC6表达，而对TRPC4表达无影响，并通过上调CaSR导致PASMC的增殖。