第一部分骨髓间充质干细胞定向分化内皮细胞的实验研究目的:建立可以在体外稳定地获得大量高纯度内皮细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定。材料和方法:1.取4周龄SD大鼠,雌雄不拘,无菌条件下提取原代骨髓间充质干细胞,体外通过全髓贴壁法培养、纯化、扩增,将获得的P3-BMSCs采用流式细胞术进行细胞表面抗原鉴定,应用的抗体为CD29和CD34。2.取P3-BMSCs分为2组:实验组和对照组;实验组细胞在L-DMEM(20%FBS+10ng/ml VEGF)条件下培养14d;对照组细胞以未加特殊诱导剂的L-DMEM+10%FBS的培养液培养14d;每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,培养到7d和14d时取实验组和对照组细胞爬片,用Anti-FactorⅧ进行免疫细胞化学鉴定。结果:1.通过全髓贴壁法可获得均质性较好的细胞,获得的细胞培养到第3代时经流式细胞术鉴定发现,细胞表达CD29的阳性率超过96%,而不表达CD34;BMSCs为均一的长梭形,漩涡状、团簇状生长,在体外增殖能力强。2.实验组P3-BMSCs经L-DMEM(20%FBS+10ng/ml VEGF)诱导培养后,细胞逐渐变的粗大, 10d左右倒置显微镜下出现明显的“鹅卵石”样形态,而对照组仍为均一的长梭形,漩涡状、团簇状生长,细胞形态无明显变化;用免疫细胞化学技术鉴定发现,诱导7d和14d的细胞表达Anti-FactorⅧ的阳性率分别为82%和93%,而对照组细胞阴性表达Anti-FactorⅧ。结论:通过全髓贴壁法可获得数量足够的、均质的骨髓间充质干细胞;BMSCs在L-DMEM(20%FBS+10ng/ml VEGF)诱导条件下可以定向分化为内皮细胞,通过此法可在体外获得大量高纯度的内皮细胞。第二部分骨髓间充质干细胞定向分化平滑肌细胞的实验研究目的:建立可以在体外稳定地获得大量高纯度平滑肌细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定。材料和方法:实验组细胞P3-BMSCs在L-DMEM(20%FBS+2ng/ml PDGF-BB)条件下诱导培养14d;对照组P3-BMSCs以未加特殊诱导剂的L-DMEM+10%FBS培养液培养14d;每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,培养7d和14d时取实验组和对照组细胞爬片,分别用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin进行免疫细胞化学鉴定。结果: P3-BMSCs经L-DMEM(20%FBS+2ng/ml PDGF-BB)诱导培养后,细胞体积逐渐变大,呈不规则梭形,密集与稀疏相交错,形成“峰-谷”状形态,而对照组仍为均一的长梭形,漩涡状、团簇状生长,细胞形态无明显变化;分别应用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin进行免疫细胞化学检测,结果显示:7d和14d时实验组细胞表达Anti-Actin alpha的阳性率分别为78%和87%,而Anti-Vimentin表达为阴性;对照组细胞对Anti-Actin alpha和Anti-Vimentin均呈阴性表达。结论: BMSCs在L-DMEM(20%FBS+2ng/ml PDGF-BB)诱导条件下可以定向分化为平滑肌细胞,通过此法可在体外获得大量高纯度的平滑肌细胞。第三部分骨髓间充质干细胞定向分化成纤维细胞的实验研究目的:建立可以在体外稳定地获得大量高纯度成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定。材料和方法:实验组细胞P3-BMSCs在L-DMEM(20%FBS+20ng/ml b-FGF)条件下进行诱导培养14d,对照组P3-BMSCs以未加特殊诱导剂的L-DMEM+10%FBS的培养液培养14d;每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,培养7d和14d时取实验组和对照组细胞爬片,分别用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin进行免疫细胞化学鉴定。结果: P3-BMSCs经L-DMEM(20%FBS+20ng/ml b-FGF)诱导培养后,细胞逐渐变得细长,纺锤形,呈束状、网状排列生长,而对照组仍为均一的长梭形,漩涡状、团簇状生长,细胞形态无明显变化;分别应用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin进行免疫细胞化学鉴定,结果显示:实验组细胞诱导培养7d和14d时,细胞表达Anti-Actin alpha的阳性率分别为72%和82%,表达Anti-Vimentin的阳性率分别为75%和85%;而对照组细胞对Anti-Vimentin和对Anti-Actin alpha均呈阴性表达。结论: BMSCs在L-DMEM(20%FBS+20ng/ml b-FGF)诱导条件下可以定向分化为成纤维细胞,通过此法可在体外获得大量高纯度的成纤维细胞。