第一部分星形细胞对胶质瘤耐药性的影响及机制研究研究背景胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是中枢神经系统中最常见且最致命的原发性肿瘤,因其浸润生长的特点,手术完全切除十分困难。虽然手术联合放疗和化疗能增加GBM患者生存期,但其预后仍差,复发率高,中位生存期仅为14.6个月。相关研究显示,胶质瘤对化疗药物的耐受性是患者术后复发、生存期缩短的重要原因之一。替莫唑胺(temozolomide, TMZ)和长春新碱(vincristine,VCR)是临床上常用的、用于治疗胶质瘤的两种不同机制的抗肿瘤药物,虽然在体外实验中能有效的杀伤肿瘤细胞,但因耐药性的存在,其临床效果不佳。因此,寻找逆转胶质瘤耐药性的新策略或增强化疗药物的敏感性,对胶质瘤治疗十分重要,也是目前临床试验的重点。目前传统的肿瘤耐药性研究仅关注肿瘤本身,而忽略了肿瘤微环境尤其是肿瘤基质细胞的影响。越来越多的研究显示,肿瘤相关基质细胞在肿瘤耐药性形成中发挥重要作用。星形细胞在脑基质细胞中数目最多,分布最广,是胶质瘤微环境中最为独特的基质细胞群。而且,星形细胞是脑组织中第一个与胶质瘤细胞起作用并将其包绕的细胞类型。在缺血和创伤等病理条件下,星形细胞活化,可以使神经元免受损伤诱导的凋亡。研究发现星形细胞在胶质瘤的生长、侵袭和血管生成中起重要作用。然而目前针对星形细胞对胶质瘤耐药性影响及其机制的系统研究甚少。研究目的本实验检测星形细胞是否影响胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,探讨星形细胞影响胶质瘤耐药性的内在机制,深入理解肿瘤微环境对胶质瘤耐药性的影响,从而为胶质瘤耐药性新治疗靶点的发现、寻找更为有效的控制肿瘤的策略、提高胶质瘤治疗疗效提供理论和实验依据。研究方法和结果1.人星形细胞通过与胶质瘤细胞直接接触降低其对化疗药物的敏感性为检测星形细胞对胶质瘤耐药性的影响,我们建立星形细胞和CFSE标记的胶质瘤细胞的共培养模型,应用Annexin V/PI方法检测胶质瘤细胞的凋亡水平。实验结果显示：与人星形细胞共培养后,胶质瘤细胞系A172的凋亡比例下降约50%,提示星形细胞能降低胶质瘤细胞对化疗药物TMZ和VCR的敏感性。为检测星形细胞是通过与胶质瘤细胞直接接触还是通过分泌细胞因子发挥化疗保护作用,我们建立直接接触和transwell间接共培养模型。结果显示,直接接触共培养组中A172的凋亡比例明显下降,但在tranwell间接共培养组中,其凋亡水平下降并不显著。以上结果显示,星形细胞的化疗保护作用依赖于星形细胞与胶质瘤细胞之间的直接接触。2.星形细胞通过与胶质瘤细胞形成缝隙连接通道(gap junctional communication, GJC)提高胶质瘤细胞的耐药性缝隙连接通道(GJC)是细胞间直接接触形成一个重要结构,在肿瘤细胞的凋亡和死亡过程中发挥重要作用。本实验通过dye transfer实验,检测星形细胞与胶质瘤细胞间是否存在通过GJC的物质交换；通过加入GJC阻断剂CBX,检测星形细胞与胶质瘤细胞间形成的GJC对胶质瘤耐药性的影响。实验结果显示,星形细胞与胶质瘤细胞间存在通过GJC的小分子物质交换,而且该过程可被CBX阻断；在直接接触共培养组中加入CBX阻断星形细胞与胶质瘤细胞间的GJC,能逆转星形细胞对胶质瘤的化疗保护作用,提示星形细胞通过与胶质瘤形成GJC提高胶质瘤细胞的耐药性。3.GJC介导的星形细胞对胶质瘤的化疗保护作用依赖于连接蛋白43(connexin 43, Cx43)在中枢神经系统和胶质瘤中,连接蛋白43(Cx43)是构成GJ的主要蛋白。我们通过细胞免疫荧光实验检测星形细胞和胶质瘤细胞Cx43的表达情况；通过小干扰RNA技术敲低A172细胞Cx43表达后与星形细胞进行dye transfer实验和共培养凋亡实验,检测Cx43对这两种细胞间物质交换和凋亡的影响。实验结果显示,星形细胞和胶质瘤细胞均表达Cx43,两种细胞间可形成GJC；将胶质瘤细胞敲低Cx43后与星形细胞共培养,其染料传递比例明显下降,并且与CBX组相比无显著性差异,提示Cx43可能是构成星形细胞与胶质瘤细胞间功能性GJC的主要蛋白。同时流式结果显示,共培养组中转染siCx43的胶质瘤细胞的凋亡水平与单独培养组相比,无显著性差异,并且加入CBX不显著影响其凋亡水平。以上结果提示GJC介导的星形细胞对胶质瘤的化疗保护作用是依赖于Cx43的。4.星形细胞通过GJC调控胶质瘤细胞内Ca2+浓度、防止钙超载,降低胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性钙离子是可通过GJ在细胞间进行传递的重要的第二信使,在激活和执行细胞凋亡和死亡中起关键作用。我们通过Fluo-3AM标记法,用流式细胞技术检测各实验组细胞内钙离子浓度及变化,验证Ca2十在星形细胞调控胶质瘤细胞凋亡中起关键作用。实验结果显示,胶质瘤细胞的Ca2+浓度随细胞凋亡的升高而升高,并且加入Ca2+螯合剂BAPTA能降低化疗药物诱导的细胞凋亡；星形细胞内的Ca2+浓度要显著低于A172单独培养组；与星形细胞共培养后,A172细胞内Ca2+浓度降低,共培养组细胞内Ca2+浓度聚集速度要显著慢于单独培养组,并且该过程可被CBX阻断。以上结果提示,在化疗药物作用下,星形细胞和胶质瘤细胞内的Ca2+浓度不平衡,可能存在通过GJC的Ca2+流。因此,星形细胞可能通过GJC调控胶质瘤细胞内Ca2+浓度,防止钙超载,抑制胶质瘤细胞的凋亡。5.人星形细胞与胶质瘤细胞的相互作用为了证实星形细胞与胶质瘤细胞间存在相互作用,我们通过免疫组化GFAP染色检测胶质瘤标本中星形细胞的分布和功能状态。结果显示胶质瘤周围有GFAP阳性星形细胞的浸润和包绕,且处于活化状态,表现为GFAP表达升高且形态向星形转变。体外实验中,免疫荧光结果也显示与A172共培养的星形细胞GFAP表达升高,处于活化状态。以上结果提示浸润的星形细胞与胶质瘤细胞间存在直接接触和相互作用。因此,在体内星形细胞也可能保护胶质瘤细胞免受化疗药物的损害。结论1.肿瘤微环境中的星形细胞能降低胶质瘤细胞对化疗药物TMZ和VCR的敏感性。2.星形细胞通过与胶质瘤细胞直接接触形成GJC,调控胶质瘤细胞内Ca2+浓度,防止钙超载,降低胶质瘤细胞的凋亡。3.星形细胞与胶质瘤细胞间的GJC依赖于Cx43。4.星形细胞与胶质瘤细胞间存在相互作用,临床应用化疗药物治疗胶质瘤时应考虑星形细胞的影响,可联合应用GJC阻断剂CBX,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。5.星形细胞与胶质瘤细胞间的Cx43—GJC可作为胶质瘤耐药性治疗的新靶点。结论1.肿瘤微环境中的星形细胞能降低胶质瘤细胞对化疗药物TMZ和VCR的敏感性。2.星形细胞通过与胶质瘤细胞直接接触形成GJC,调控胶质瘤细胞内Ca2+浓度,防止钙超载,降低胶质瘤细胞的凋亡。3.星形细胞与胶质瘤细胞间的GJC依赖于Cx43。4.星形细胞与胶质瘤细胞间存在相互作用,临床应用化疗药物治疗胶质瘤时应考虑星形细胞的影响,可联合应用GJC阻断剂CBX,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。5.星形细胞与胶质瘤细胞间的Cx43—GJC可作为胶质瘤耐药性治疗的新靶点。第二部分星形细胞对胶质瘤迁移和侵袭的影响及其机制研究研究背景胶质瘤的侵袭特性,使手术完全切除十分困难并介导对目前治疗手段的耐受性,是胶质瘤患者预后差的主要原因。因此,制定新策略治疗胶质瘤的侵袭特性或深入理解调控胶质瘤侵袭的机制,对胶质瘤的治疗极为关键。越来越多的研究显示,肿瘤微环境尤其是肿瘤基质细胞影响肿瘤的恶性生物学行为。而星形细胞是人脑中数目最多的胶质细胞,是胶质瘤微环境中重要的基质细胞群。有研究显示,星形细胞能增强胶质母干样细胞的侵袭能力,并在肿瘤的生长、血管生成中起重要作用。此外,星形细胞还能通过分泌大量细胞因子影响肿瘤的增殖和侵袭能力。胶质瘤微环境中的另一种基质细胞——小胶质细胞,影响胶质瘤侵袭的机制已经得到深入阐述,但星形细胞对胶质瘤侵袭的影响及机制研究仍较少。MMP14是MMP家族的一种跨膜蛋白,能通过裂解膜表面糖蛋白CD44或通过与TIMP-2结合为复合物进而激活MMP2或MMP9,促进肿瘤的迁移和侵袭。研究显示,多种侵袭性肿瘤和基质细胞的MMP14表达上调,并且小胶质细胞或胶质瘤细胞的MMP14逐渐成为胶质瘤治疗的新靶点。IL-6是一种调节免疫和炎症反应的细胞因子。近年来有研究显示,IL-6能通过增强MMP2和MMP9的活性促进胶质瘤的迁移和侵袭,因此,IL-6可能通过影响MMP14的活性或表达来调控MMP2或MMP9的活性。基于以上研究,我们提出：星形细胞能通过分泌大量细胞因子如IL-6来调控胶质瘤细胞MMP14的表达,进而影响肿瘤的迁移和侵袭能力。研究目的本实验的目的是通过研究肿瘤微环境中的星形细胞对胶质瘤迁移和侵袭特性的影响,深入探究星形细胞促进胶质瘤迁移和侵袭的机制,为胶质瘤的临床治疗,尤其是对其侵袭特性的治疗,提供新的治疗靶点和实验依据。研究方法和结果1.人星形细胞提高胶质瘤的迁移和侵袭能力通过transwell迁移和侵袭实验,检测星形细胞对胶质瘤迁移和侵袭特性的影响。结果显示,人星形细胞能通过分泌细胞因子显著提高胶质瘤细胞系U251和A172的迁移和侵袭能力。2.星形细胞通过分泌细胞因子上调迁移和侵袭相关的基因和蛋白并激活相关信号通路用星形细胞培养上清(ACM)分别刺激胶质瘤细胞系U251和A172, qRT-PCR或Western blot方法检测并筛选迁移和侵袭相关基因和蛋白如MMP和Rho家族,结果显示MMP14表达上调最为显著；检测迁移和侵袭相关信号通路,发现ERK1/2、AKT和p38MAPK信号通路被激活。3.星形细胞上清能诱导胶质瘤细胞膜表面MMP14的表达,并通过激活MMP2而不是裂解CD44,促进胶质瘤的迁移和侵袭用星形细胞培养上清刺激胶质瘤细胞,通过流式细胞技术检测膜蛋白的表达情况,发现胶质瘤细胞膜表面MMP14表达上升,而CD44没有变化。用小干扰RNA技术下调胶质瘤细胞MMP14的表达,明胶酶谱实验显示其分泌的MMP2活性降低,transwell迁移和侵袭实验显示其迁移、侵袭能力明显下降；而用ACM上调胶质瘤细胞膜表面MMP14表达后,其分泌的MMP2活性上升。以上结果提示星形细胞能通过分泌细胞因子上调胶质瘤细胞膜表面MMP14的表达,进而通过激活MMP2而不是裂解CD44促进胶质瘤的迁移和侵袭能力。4.星形细胞通过分泌IL-6上调胶质瘤细胞膜表面MMP14的表达通过蛋白芯片对各组培养上清进行检测并筛选迁移和侵袭相关细胞因子,然后通过ELISA和qRT-PCR进行验证,结果显示IL-6变化最为显著。通过Western blot和流式细胞技术检测IL-6对MMP14表达的影响,结果显示IL-6能上调胶质瘤MMP14的表达,并且加入IL-6中和抗体能抑制ACM诱导的MMP14表达上调。以上结果提示,由星形细胞分泌的、能上调胶质瘤细胞MMP14表达的关键细胞因子是IL-6。5.胶质瘤标本中MMP14与IL-6的表达正相关,并且两者均与胶质瘤WHO分级和生存期相关通过免疫组化对胶质瘤标本连续切片进行IL-6和MMP 14染色发现,IL-6和MMP14的表达均与肿瘤级别(WHO分级)正相关,与患者生存期负相关,是胶质瘤患者的独立预后因素；相关性分析结果显示MMP14的表达与IL-6正相关；正常脑组织(取自脑疝减压患者)高表达IL-6,提示在体内星形细胞分泌的IL-6仍能促进胶质瘤MMP14的表达,并且IL-6和MMP14是判断胶质瘤患者预后的重要标志物。结论1.星形细胞通过分泌细胞因子上调胶质瘤细胞膜表面MMP14的表达,进而激活MMP2促进胶质瘤的迁移和侵袭能力。2.引起胶质瘤细胞MMP14表达上调且由星形细胞大量分泌的细胞因子是IL-6。3.胶质瘤标本中,胶质瘤细胞的MMP14表达水平与IL-6正相关,并均与胶质瘤WHO级别正相关,是胶质瘤患者的独立预后因素。4.星形细胞与胶质瘤细胞间的IL-6—MMP14轴可能是胶质瘤侵袭治疗的潜在靶点。