流行性感冒（简称流感）是一种常见的急性呼吸道传染病，甲型流感病毒是造成季节性流感和具有高致病性和致死率流感疫情的主要病原体。流感病毒表面有两种糖蛋白，其中一种为神经氨酸酶(neuraminidase，NA)，能够水解细胞表面多糖链末端的唾液酸残基，对于病毒复制和感染具有关键作用。NA是重要的抗病毒药物靶点，不同类型的NA蛋白在其酶活位点附近的关键氨基酸残基都高度保守，暗示以此为靶点的NA抑制剂可以广谱性地作用于多种流感病毒。根据其活性位点的特征，甲型流感病毒的NA蛋白可被划分为两组(group)，group1包括N1，N4，N5和N8，group2包括N2，N3，N6，N7和N9。在group1的NA蛋白中，其活性位点通常含有一个150洞，而group2的NA蛋白则没有。然而，被划分为group1成员的09N1蛋白却没有150洞，更类似于group2NA蛋白的结构特征。　　临床使用的抗流感药物主要有NA抑制剂和M2抑制剂两大类。靶向M2的抑制剂为金刚烷胺类药物，包括amantadine和rimantadine，靶向NA的抑制剂主要有四种为oseltamivir（达菲），zanamivir（瑞乐沙），peramivir和laninamivir。鉴于靶向M2的药物仅对甲型流感病毒有效，大部分病毒已对其产生耐药，且该类药物对人体具有副作用，因此这类药物现在已经很少使用。由于在给药方式和生物利用度方面的优势，oseltamivir被更加广泛地投入使用，由此也造成了病毒出现耐药性突变，包括多种临床突变株，如典型的H275Y突变。2013年12月，在中国江西省一位70岁的女性因感染禽源H10N8流感病毒(A/Jiangxi-Donghu/346/2013/H10N8)死亡。该病人使用oseltamivir治疗三天后死亡。相较而言，zanamivir的耐药性突变比较少见。通过体外实验在药物的选择压力下筛选流感病毒耐药性突变，研究其耐药机制，对于临床用药具有重要的指导意义。另外，耐药机制为新型抑制剂的研发提供理论基础。　　NA蛋白的活性位点包含8个保守的催化性氨基酸残基，以及11个起稳定活性位点结构作用的氨基酸残基。本研究中，H10N8亚型流感病毒在zanamivir的选择压力下，116位缬氨酸突变为天冬氨酸，尽管这个位点对于NA的酶活既无稳定结构的骨架作用，也不直接与底物相互作用，但是它重要的催化位点118位精氨酸相邻近。因此，116位氨基酸突变可能会影响118精氨酸的构象，从而导致药物敏感性下降。由于缺少直接的结构信息，我们需要更多深入研究以揭示这类非保守性氨基酸残基引起NA耐药性的分子机制。之前研究表明，Arg292Lys突变一方面引起Glu276构象发生变化，进一步影响了oseltamivir疏水基团的构象，另一方面使其失去与抑制剂分子羧基的相互作用从而产生耐药，这一位点在N9(group2)与所有经典的NA配体或抑制剂相互作用中都极为关键。随着越来越多的新型流感病毒和耐药性突变株的出现，研发新型的抗流感药物已成为当务之急。　　在此研究中，我将针对在H10N8亚型中新发现的Val116Asp（根据N8序列编号为114）突变和Arg292Lys突变讨论影响NA耐药性的分子机制研究，这两个点突变是通过体外实验分别在zanamivir和oseltamivir药物压力下筛选得到的。其中116位是位于NA酶活位点之外的一个非保守性位点，此前尚无报道能够影响NA的耐药性;而Arg292是一个保守的催化活性位点，二者都是利用H10N8(A/Jiangxi-Donghu/346/2013/H10N8)分离株筛选获得的。在进行筛选时，病毒被置于连续升高的oseltamivir（80-10240μM）或zanamivir（20-2560μM）药物浓度条件下连续进行8次传代，提取每一代病毒的基因组RNA并对其NA基因片段进行测序，然后通过序列比对分析出现的耐药性突变位点。最终分别获得了针对zanamivir和oseltamivir的耐药性点突变Val116Asp和Arg292Lys。随后，我们将N8蛋白的胞外段基因序列克隆到pFastbac1载体并引入相应的突变，利用昆虫细胞杆状病毒系统进行重组蛋白表达，然后对其进行结构和功能研究。我们分别纯化并获得了稳定的可溶性N8野生型以及Val116Asp和Arg292Lys突变体蛋白，并利用晶体学手段成功地进行了结构解析。同时，我们将NA蛋白晶体分别浸泡多种不同抑制剂的溶液中，并再次收集衍射数据以解析NA蛋白与多种抑制剂分子的复合物结构。此外，我们利用带有荧光标记的底物测试不同NA蛋白对底物的亲和力以及不同抑制剂分子的半数抑制浓度(IC50)，以此评估不同位点突变对于NA蛋白耐药性的影响。　　结果显示，Val116Asp和Arg292Lys突变体对于反应底物的米氏常数(km)相对于野生型NA蛋白分别升高了6倍和30倍。相较于Val116Asp突变体，Arg292Lys突变体对于所有NA抑制剂的敏感性都明显降低。两个突变体对于oseltamivir的耐受性都普遍高于其他抑制剂，然而Arg292Lys突变导致其对于peramivir的耐受性出现极为显著的提高(IC50提高了近3000倍，而laninamivir对于两种突变体仍然具有抑制活性尽管其敏感性相较于野生型NA蛋白有所降低。相对于其他所有NA抑制剂，两个突变体对MS-257敏感性下降程度最少，因此MS-257可能是最为有效的NA抑制剂。而带有较长连接链的四价扎那米韦(Tz12)相较于连接碳链较短者(Tz6)对于NA的抑制作用更为有效。　　结构分析显示，在Arg292Lys突变体蛋白中Glu276和Tyr406相较于野生型显示出明显不同的构象;而在Val116Asp突变体中，除了之前已经报道的Arg118构象变化外，Thr148也出现了明显的差异从而影响了150-loop区的整体构象。之前研究已经表明Glu276是一个侧链柔性较强的氨基酸，在已知的NA结构中这一位点具有两种不同的取向，或朝向酶活催化中心，或朝向Arg224。所有抑制剂分子都通过类似的经典模式与NA结合，然而在N8-R292K突变体中，Glu276朝向Arg224，从而为oseltamivir的结合提供一个非常适合的环境，这也解释了N9-Arg292Lys（属于group2NA分子）突变体显示出对于oseltamivir超过100000倍的耐受性，其Glu276便是朝向oseltamivir羧基中的疏水性戊氧基，非常不利于oseltamivir的结合。N8-Arg292Lys突变体中Glu276的取向也适合于peramivir，尽管其侧链的疏水部分朝向远离了Ile222，减弱了二者间原有的疏水相互作用。此外，通过比较抑制剂CS-8958对于group1和group2两种NA的结合模式进一步说明了同一种抑制剂分子可以通过两种不同的构象与NA分子结合，其中N8和N2中Glu276通过类似的侧链构象与CS-8958结合，而09N1则采用不同的构象。在N8-Val116Asp突变体中，Tyr347对于与抑制剂分子的结合起着较为关键的作用，而且这种模式只在group1的NA分子中被观察到。在野生型N8蛋白中，Tyr347侧链与zanamivir和oseltamivir的羧基能够形成氢键相互作用;然而在Val116Asp突变体中由于其侧链偏移不能形成氢键，这一改变影响到保守的Arg118与抑制剂分子羧基基团的相互作用。这一发现也与Russell et al.(2006)提出的非保守性氨基酸通过影响活性位点的保守性精氨酸残基构象从而产生耐药性的机制相吻合。在N8与zanamivir和oseltamivir复合物结构中，除了Tyr347和Arg118以外，Asp116还能与Thr148形成氢键相互作用;但是在Val116Asp突变体中，146-148loop的构象在与两种抑制剂结合时具有明显不同，这也影响了Asp151与oseltamivir氨基基团间的相互作用。Thr148构象的差异是解释Val116Asp突变体对于oseltamivir具有比zanamivir更高耐受力的一个关键因素，这一位点的变化直接影响了对于底物或抑制剂结合极为重要的150-1oop的构象。此外，结构还显示位于150-loop区的Asp151和Arg152分别与NA抑制剂分子的4-羟基或N-乙酰基形成关键的相互作用。当150-loop区处于开放状态时，这两个氨基酸残基远离底物唾液酸分子;而当与抑制剂分子结合时，二者发生偏移而向底物靠近。这个发现进一步说明像zanamivir这样高度类似于NA天然底物(唾液酸或其过渡态Neu5Ac2en和DANA)的抑制剂分子相较于oseltamivir更加不易产生耐药性突变。流感病毒对于多种NA抑制剂的耐药性已成为一个非常严峻的问题，对于流感的防控与临床治疗具有重大影响，因此更加合理的使用各种NA抑制剂对于保证其有效性至关重要，同时也是预防和治疗季节性流感、禽流感和大规模流感疫情最为有效的手段。本研究提供了临床上在使用抑制剂治疗后可能导致H10N8亚型流感病毒NA产生耐药性突变的关键位点信息并利用结构生物学方法揭示NA分子产生耐药性的分子机制，这对于指导临床用药和新型抑制剂研发具有重要意义。