背景葡萄膜炎(uveitis)是指一组广泛累及葡萄膜,视网膜,视网膜血管及玻璃体的炎症。也称眼内炎症(endophthalmitis)。葡萄膜炎多发于青壮年,病程长,易反复发作,病因复杂,发病机制也尚不完全清楚,故其预防较困难,治疗效果也不理想。因此,寻找合理且有效的治疗药物,是眼科领域中一个亟待解决的问题。非特异性和特异性免疫反应都可引起葡萄膜炎,多种抗原诱导的实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是代表人类由特异性免疫反应引起的葡萄膜炎的经典动物模型。研究表明EAU是由T细胞介导的,CD4+T细胞在EAU的发生和发展中起着重要的调控作用。光感受器间维生素A类结合蛋白(IBBP)特异性的Thl/IFN-γ和(或)Th17/IL-17在EAU中均具有致病作用。最近研究报道肝脏X受体(LXR)可以调节炎症和自身免疫性疾病的发生发展,LXR通过抑制Thl和Th17细胞的分化从而减轻炎症和自身免疫性疾病。研究表明LXR激动剂可以减轻实验性自身免疫性脑炎(EAE)和胶原诱导的关节炎(CIA)等动物模型的全身性免疫反应,也可以减轻糖尿病视网膜病变(DR)小鼠的眼局部炎症反应。但其在自身免疫性葡萄膜炎中的作用尚不清楚。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一种多效性的细胞因子,是固有免疫反应和适应性免疫反应的上游激活因子,具有促炎作用,能够拮抗糖皮质激素激素(GC)的抗炎作用。最近本团队研究己表明MIF基因的2个单核苷酸多态性(SNP)位点与白塞氏病(BD)和Vogt-小柳原田(VKH)患者具有相关性。但MIF在葡萄膜炎中的作用及机制尚需进一步研究。基于以上研究背景,本课题的研究包括以下两部分实验：1.探讨LXR和MIF在EAU小鼠视网膜组织中的表达水平,确定其是否参EAU眼部炎症反应的发生和发展。2.进一步探讨LXR和MIF在EAU眼部炎症反应中的作用及机制。通过上述研究,以期阐明LXR和MIF在EAU中的作用及机制,为葡萄膜炎的发病机制提供新思路,并为其防治提供新策略和新靶点。第一部分 LXR在EAU眼部炎症反应中的作用及机制研究目的：LXR是一种配体激活转录因子,主要作用是调节胆固醇和脂质代谢。近年研究发现LXR在炎症和免疫调节中也起着重要作用。本实验通过对IRBP诱导的EAU小鼠进行LXR激动剂]TO901317(TO90)干预,观察LXR葡萄膜炎中的作用及其潜在机制。方法：B10.RⅢ小鼠皮下注射IRBP诱导EAU模型,分别给予T090和溶媒进行干预。分别对小鼠眼前段和眼后段进行临床评分和病理评分,用荧光定量PCR(real time-PCR)的方法检测小鼠视网膜中LXRs、炎症因子和转录因子p65的mRNA水平,用Western blotting的方法检测LXRs、LXRs靶基因ABCA1及p65的蛋白水平。结果：(1) LXRa和LXRβ在正常小鼠视网膜组织中均有表达。与正常小鼠相比,EAU小鼠视网膜组织中LXRa的表达上调,而LXRβ的表达无明显差异。(2) 正常小鼠进行T090干预后,靶基因ABCA1的蛋白水平上调。而EAU小鼠进行T090干预后,与EAU小鼠溶媒处理组相比,ABCA1的蛋白水平也上调。表明LXR受体是配体依赖型的,在EAU小鼠中给予T090后LXRa被激活。(3) 给予T090的EAU小鼠,炎症高峰期眼内炎症的临床评分和组织学评分均显著低于溶媒治疗组,表明T090减轻了EAU的眼部炎症反应程度。同时,促炎细胞因子TNF-、IL-6、IL-1β、MCP-1、IL-17和IFN-γ的表达显著降低。(4) 与给予溶媒的EAU小鼠相比,T090抑制了EAU小鼠IRBP特异性的系统免疫反应,同时抑制了Thl和Th17细胞极化,核转录因子亚单位p65的水平明显下调。结论：在EAU中,T090激活了LXRa,显著改善了EAU的炎症反应程度。在EAU预防和治疗阶段给予T090均能抑制EAU小鼠Th1/IFN-y和Th17/IL-17的极化。T090在EAU中的抑炎作用与NF-κB信号通路抑制有关。LXR可能成为干预葡萄膜炎的新靶点。第二部分 MIF在EAu眼部炎症反应中的作用及机制研究目的：MIF是先天性和适应性免疫反应的上游激活因子,具有促炎作用。在风湿性关节炎和动脉粥样硬化等疾病中起着重要的免疫调节作用。然而,MIF在自身免疫性疾病葡萄膜炎中的作用及其机制尚不清楚。本实验通过干预EAU小鼠中MIF的表达,研究MIF在EAU中的作用及可能的机制。方法：以腺相关病毒(AAV)为载体,构建AAV8.CBA.MIF进行小鼠视网膜下注射过表达MIF基因。3周后IRBP皮下注射建立EAU小鼠模型。低表达MIF基因即在EAU小鼠中给予MIF拮抗剂ISO-1。用real time-PCR检测视网膜组织细胞因子mRNA的表达,视网膜电图(ERG)检测小鼠视功能,Western blotting检测视网膜组织蛋白的表达,利用流式(FCM)检测IL-17和IFN-y阳性T细胞的比例。结果：(1) 与正常小鼠相比,EAU小鼠炎症高峰期视网膜组织中MIF及其受体CD44和CD74的表达升高。(2) 与视网膜下注射AAV8.CBA.eGFP的EAU小鼠相比,视网膜下注射AAV8.CBA.MIF的EAU小鼠视网膜组织中促炎细胞因子水平明显上调,ERG检测结果表明a波和b波振幅均降低。同时,Notch信号通路中Notch1、Notch4和DLL4的表达升高,活化的Notch分子NICD及经典靶基因Hes-1的表达上调。视网膜下注射AAV8.CBA.MIF的EAU小鼠给予了Notch信号通路抑制剂DAPT后,与应用溶媒组相比,EAU小鼠视网膜组织中促炎细胞因子水平明显下调,减轻了眼内炎症反应。(3) 在EAU小鼠中给予MIF拮抗剂ISO-1使其低表达后,EAU小鼠眼内炎症的严重程度降低,视网膜组织促炎因子水平降低,小鼠视网膜组织和玻璃体腔内巨噬细胞特异性的F4/80抗体染色阳性的细胞数量减少,脾脏和淋巴结来源的淋巴细胞中IL-17和IFN-y阳性T细胞的比例均下降。结论：EAU小鼠中过表达MIF促进眼内炎症反应的程度。Notch信号通路参与EAU中MIF促炎的病理过程。MIF与Notch信号通路之间的相互作用在调节EAU的眼内炎症中起着重要作用,MIF与Notch信号通路可能是EAU有效的干预靶点。