增生性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)是严重的致盲性眼病之一,临床上复杂难治。虽然近年来随着手术技巧和设备的改进提高了视网膜脱离复位手术的成功率,但反复增殖并非少见,仍是视网膜脱离复位术失败的首要原因。药物防治PVR具有重要意义。目前药物防治已经成为PVR研究的热点。但由于血-眼屏障的阻挡,眼表和全身用药难以在玻璃体腔中达到有效的治疗浓度。实验及临床中已经采用玻璃体腔注药的方式将高浓度药物靶向输送至眼内组织治疗玻璃体视网膜病变。然而因药物半衰期所限,往往需要多次玻璃体腔注药以达到持续的眼内药物治疗浓度。但反复多次的玻璃体腔注射也会产生诸多弊端：一方面会给患者造成操作的不适和情绪及经济负担,同时需要患者很好的依从性；另一方面可能产生晶状体损伤、玻璃体积血、视网膜脱离、眼内炎等严重损害视功能的并发症。姜黄素是自传统中药姜黄中提取的酚类疏水性化合物,具有广泛的健康功能和药理活性,已有多项研究证实姜黄素具有抗纤维化、抗肿瘤、抗炎症、抗菌、抗氧化及低毒性等多种药理活性。姜黄素对于PVR等增生性疾病具有广阔的应用前景。但是由于姜黄素为疏水性化合物,组织吸收率低,药物代谢率快及系统排出迅速,因而限制了姜黄素在临床上的应用。为增加姜黄素的生物利用度并减少玻璃体腔注药所可能引起的并发症,本课题将首先制备载有姜黄素的生物可降解巩膜塞并对其体外药物动力学进行初步研究,进而将制备成的载有不同剂量姜黄素的生物可降解巩膜塞嵌置在兔眼巩膜壁睫状体平坦部对其与周围组织的生物相容性及毒副作用及玻璃体内的药物动力学进行研究,最后通过玻璃体腔注射自血制作PVR兔眼模型,观察巩膜睫状体平坦部置人载有姜黄素的生物可降解巩膜塞对兔眼PVR模型的防治效果,从而全面评价其防治PVR的可行性问题,探讨应用姜黄素防治PVR更佳的给药方式。第一部分 制备载有姜黄素的生物可降解巩膜塞及其体外动力学研究目的 制备一种可以嵌置在睫状体扁平部巩膜壁上,可以缓慢释放姜黄素至玻璃体腔的生物可降解巩膜塞形的药物释放系统并对其体外药物动力学作一初步研究。方法 应用Octagon 200振动筛粉器将聚乳酸聚乙醇酸共聚物(polylactide-co-glycolide,PLGA姜黄素制成100um大小颗粒,将不同剂量的姜黄素与PLGA按1：5均匀混合后置于巩膜塞模具中压制成巩膜塞。再将模具连同其内的巩膜塞置于烤箱中,烧结温度设置在55℃范围,持续30分钟。将制备好的载有不同剂量姜黄素的巩膜塞置人装有1.5ml平衡盐溶液的玻璃试管内,37℃温浴,每24小时收集BSS姜黄素洗脱液。试管中则加入新鲜BSS 1.5ml,如此循环重复14天。应用高效液相色谱技术(HPLC)检测各时间点BSS洗脱液内姜黄素药物质量浓度。结果：制备成分别含有0.5mg、1.0mg、1.5mg三种剂量姜黄素的生物可降解巩膜塞,直径约lmm,长约5mm。体外动力学结果显示以PLGA为载体物质的姜黄素生物可降解巩膜塞可持续释放姜黄素,含有三种姜黄素剂量的巩膜塞均在第一个24小时测试点释放量最大,达浓度峰值,第二个24小时后释放量降低并呈相对稳定的速度缓慢释放。BSS洗脱液中姜黄素质量浓度结果显示含有1.5mg姜黄素的巩膜塞持续14天均高于15ug/ml,1.0mg姜黄素的巩膜塞持续12天高于15ug/ml,其余两天略低于15ug/ml,含有0.5mg姜黄素的巩膜塞持续14天低于15ug/ml。结论：可以应用PLGA作为载体物质与不同剂量的姜黄素混合制备生物可降解的巩膜塞形药物释放系统,体外动力学检测其可稳定释放一定量的姜黄素14天,其中含有1.5mg、1.0mg姜黄素的生物可降解巩膜塞在BSS液中的质量浓度可在一定的时间内持续高于15ug/ml。第二部分载有姜黄素的生物可降解巩膜塞的眼部组织相容性及毒性研究目的：对载有姜黄素的生物可降解巩膜塞置人巩膜壁后其对周边眼部组织生物相容性及毒性问题进行研究以期对这种给药方式在眼部应用的安全性问题进行评价。方法：共44只实验用兔,其中32只实验用兔随机分为对照组,0.5mg组,1.0mg组及1.5mg组4组,每组8只。对照组为选取每只兔的右眼只做巩膜穿刺而不植入巩膜塞。其余三组则选取每只兔的右眼结膜下巩膜壁嵌置载有不同剂量姜黄素的巩膜塞。其余12只兔随机分成上述4组,每组3只,双眼使用方法同上(本组供14d、28d、60d时摘取眼球使用)。分别于巩膜壁嵌置巩膜塞后1、7、14、21、28d测量各实验眼眼压、应用裂隙灯观察结膜反应、前房炎症反应以及角膜透明性,间接检验镜观察玻璃体视网膜情况,并在各检查点对实验眼进行暗适应ERG检查。对在14d、28d、60d摘取的眼球行光镜及电镜组织学检查。结果：巩膜塞植入后各检查时间点,对照组与各剂量巩膜塞组实验眼眼压各组间差异无统计学意义。实验后1d、7d各实验组均有不同数量的实验眼出现程度不同的结膜反应,但各组间差异无统计学意义(F=0.301, P=0.824;F=0.333,P=0.801),其余各实验检查点无结膜炎症反应,实验整个过程,未发现巩膜穿刺口渗漏,各实验眼角膜透明,无前房反应,也未见玻璃体积血、视网膜脱离等并发症。ERG检查各组各时间点,实验组眼a波和b波振幅与对照组眼相比差异无统计学意义。各时间点视网膜组织学检查未见异常改变。结论：应用PLGA作为药物载体的姜黄素生物可降解巩膜塞植入巩膜穿刺口,巩膜塞与穿刺口间密闭性好,无渗漏,无炎症反应,对周边组织无损伤,经过1至2个月巩膜塞自然降解,无需二次手术取出,可以作为姜黄素治疗PVR的新型给药装置。为更好的发挥姜黄素各种药理活性提供了新的给药形式。第三部分载有姜黄素的生物可降解巩膜塞在兔眼玻璃体腔内的药物动力学研究目的：探讨载有姜黄素的生物可降解巩膜塞置人眼内后玻璃体内的药物释放特点,为临床应用提供参考依据。方法：将22只新西兰白兔随机分为标准组及质控组各3只兔(6只眼)和实验组16只兔。实验组再随机分为2组,分别为1.0mg、1.5mg组,每组8只兔。标准及质控组动物不行巩膜壁巩膜塞置人操作,只行玻璃体抽取,实验组右眼于角膜缘后3mm巩膜壁嵌入载有姜黄素的生物可降解巩膜塞,分别于巩膜壁置人巩膜塞后Id、7d、14d、21d、28d抽取并制备玻璃体待检样品。应用高效液相色谱技术(HPLC)检测玻璃体腔内药物质量浓度。结果：姜黄素与玻璃体内源性物质之间的色谱峰分离良好,姜黄素保留时间为4.3 min。提取回收率约90%,日内、日间变异较小。玻璃体内姜黄素质量浓度在2-128 μg/mL范围内呈线性关系,标准曲线为y=32572x+46109(r=0.999)。所有植入载有姜黄素的生物可降解巩膜塞的实验眼玻璃体内持续4周均检测到不同浓度的姜黄素。1.5mg、1.0mg两种剂量的巩膜塞组均在7d时间检测到玻璃体内姜黄素浓度达到峰值浓度,分别为45.71土5.61和24.18±2.14(μg/mL);28d所测得的玻璃体内姜黄素浓度最低,分别为9.51土1.03和7.23±0.83(μig/mL)。1.5mg、1.0mg组玻璃体内姜黄素浓度分别持续21d、14d维持在15ug/ml之上。结论：载有姜黄素的生物可降解巩膜塞嵌置在巩膜壁后可以持续释放姜黄素至玻璃体腔持续至少4周以上,药物浓度可持续稳定在姜黄素抑制RPE细胞增殖的最佳有效浓度15ug/ml以上,可以作为姜黄素抑制PVR的新型给药方法。第四部分兔眼增生性玻璃体视网膜病变模型的建立及相关因子的测定目的：在药物防治PVR的研究过程中,选择一种操作简单、节约成本、成模率高的制作PVR模型的方法并应用抗体芯片方法检测实验眼玻璃体样本中相关因子的表达。方法：新西兰白兔16只,随机分为对照组和模型组,每组8只,右眼为实验眼。所有实验兔眼在角膜缘后3mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部,勿伤及晶状体及周边视网膜,用穿刺刀向两侧扩大切口,切口与角膜缘平行达4mm,用8-0可吸收线间断缝合切口后以2ml注射器从穿刺口进针抽取0.2ml玻璃体。对照组注入0.2mlBSS液,模型组注入0.2ml自血。术后1、3、7、14、21和28d进行裂隙灯显微镜、间接眼底镜等眼科检查;眼科B超检查玻璃体和视网膜情况。眼后节PVR分级采用Fastenberg分级方法：0级：眼底正常,视网膜在位,玻璃体无混浊无增殖膜;1级：玻璃体混浊并可见增殖膜;2级：局灶性牵拉,局限性血管改变,充血扩张等,3级：髓线处的局限性网脱以及视网膜皱褶;4级：广泛的视网膜脱离,全部髓线脱离,视盘周围视网膜脱离;5级：视网膜全脱离、对折以及裂孔形成。分别于操作后Id、7d、14d、21d、28d采取玻璃体样本,应用QAL-CYT-2芯片检测各检测点抽取的玻璃体样本中IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-21、MMP-9、leptin, MIP-1β、NCAM-1、 TNF-α等细胞因子的表达。结果：对照组术后各时间点无PVR发生。模型组术后PVR分级7d时5只眼0级(只存在玻璃体混浊未见增生膜同时存在)、3只眼1级;14d时1只眼0级、5只眼1级,1只眼2级、1只眼3级;21d时2只眼2级、5只眼3级、只眼4级;28d时2只眼3级、4只眼4级、2只眼5级。实验后各检测点模型组玻璃体中IL-1α,IL-1β、IL-8、Leptin、MMP-9、NCAM-1、TNF-α的表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-α, MMP-9随时间进展表达量逐渐增高,至14-21d达到峰值。在各时间点对照组实验眼玻璃体中未检测到IL-17、IL-21的表达,在14d、21d检测点模型组玻璃体中IL-17的表达分别为1.2±0.50pg/ml、9.2±3.9pg/ml,7d、14d模型组玻璃体中IL-21的表达分别为6.0±2.3、9.8±3.0pg/ml。其余时间点实验眼未检测到IL-17、IL-21的表达。各时间点模型组荧光扫描图显示荧光亮度或面积均高于或大于对照组。实验后各检测点模型组与对照组均未检测到MIP-1β的表达。结论:兔眼距角巩膜缘3mm处巩膜穿刺抽取玻璃体联合玻璃体腔注射自血建立PVR模型的方法操作简单,成模时间快,成模率高,可检测到多种炎症因子表达,可作为药物防治PVR研究的实验模型。第五部分载有姜黄素的生物可降解巩膜塞对兔增生性玻璃体视网膜病变及相关因子的抑制作用研究目的：探讨载有姜黄素的生物可降解巩膜塞置人巩膜壁后对自血玻璃体腔注射制作的PVR病变程度及相关因子的抑制作用。方法：选用新西兰白兔30只,随机分为模型组与治疗组,每组各15只,右眼为实验眼。模型组：玻璃体腔注射自血;治疗组：玻璃体腔注射自血+巩膜壁嵌置载有1.5mg姜黄素生物可降解巩膜塞。术后Id、3d、7d, 14d、21d和28d使用裂隙灯显微镜观察角膜、房水、晶状体、前节炎症反应情况;使用间接检眼镜和B超检查玻璃体视网膜情况。PVR分级采用FastenbergPVR分级方法分级。分别于巩膜壁嵌置巩膜塞后1d、7d、14d、 21d、28d采取玻璃体样本,应用QAL-CYT-2芯片检测各检测点采取的玻璃体样本中IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-2、MMP-9、leptin、MIP-1β NCAM-1、TNF-α等细胞因子的表达。结果：各检测时间点治疗组PVR的发展程度及分级均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);抗体芯片技术检测结果,各检测时间点治疗组IL-1α、IL-1β、IL-8、MMP-9、TNF、NCAM-1、leptin的表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-17因子在14d时模型组为1.2±0.5pg/ml,21d时模型组、治疗组玻璃体中的表达分别为9.2±3.0pg/ml、6.2±2.1pg/ml,差异有统计学意义(t=3.148,P=0.004),其余测试点模型组与治疗组未检测到该因子的表达;7d、14d模型组、治疗组玻璃体中IL-21的表达分别为6.0±2.2、3.8±1.3 pg/ml; 10.0±3.0、6.8±1.9pg/ml,组间有显著性差异(t=3.169,P=0.004; t=3.490,P=0.002),其余检测点未检测到该因子的表达,各时间点模型组、治疗组均未检测到MIP-1∞的表达。治疗组荧光扫描图显示荧光亮度或面积均低于或小于模型组。结论：载有1.5mg姜黄素的生物可降解巩膜塞置入自血玻璃体腔注射的实验眼巩膜壁后,可以通过抑制IL-1、IL-8、TNF、MMP-9等细胞因子的表达实现对兔眼PVR病变的抑制作用。基于上述研究结果可以得出以下结论：应用PLGA作为载体物质制备载有姜黄素的生物可降解巩膜塞,HPLC检测体外及体内药物释放量可稳定释放姜黄素保持一定浓度至少14天;巩膜塞置入兔眼巩膜壁后,组织相容性好,对视网膜无毒性,经过4-8周巩膜塞自然降解,无明显炎症、感染、渗漏发生并可有效抑制自血玻璃体腔注射所引发的PVR的发生、发展。因此这种生物可降解巩膜塞可作为姜黄素眼部应用的新的给药方式。