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胆囊结石病是常见的消化道疾病,无论是在发达国家还是在发展中国家,且又以胆固醇结石多见。随着生活水平的提高,胆囊结石的发病率也在逐渐增高。胆囊结石的危险因素涉及到环境、遗传、性别、年龄、生活方式、基因、药物、体重的迅速下降、代谢的异常等等。自从Paigen和Carey小组在小鼠发现第一个致石基因(Lith1基因)以来,到目前总共发现23个致石基因(Lith1～Lith23基因),分别定位于15条染色体,由各自的候选基因发挥功能。固醇携带蛋白2(Sterol Carrier Protein2, SCP2),定位于4号染色体,编码甾醇载体蛋白2,主要参与细胞内胆固醇的转运,也可以作为胆固醇代谢的调节因子参与胆固醇的生物合成及转化。研究己表明SCP2与胆固醇结石的形成密切相关,但其作用机制有待进一步证实。本研究通过给C57BL/6结石易感小鼠体内注射SCP2基因高表达和低表达腺病毒载体来研究SCP2基因与胆固醇结石形成的机制。一、携带ALB启动子SCP2基因腺病毒载体在Hepal-6(?)细胞的表达目的：构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体,研究其在Hepal-6细胞内的表达情况。方法：(1)利用RT-PCR技术从小鼠肝组织克隆SCP2基因cDNA序列,在其上游接入白蛋白(ALB)启动子,下游连接报告基因(GFP基因),构建穿梭质粒PDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP,用PCR、酶切和测序方法进行结果鉴定；(2)采用AdMax TM Adenoviru5Vector系统包装病毒,CsCl法纯化病毒.TCID50法测定滴度；(3)重组腺病毒感染小鼠hepa-1-6细胞24h提取RNA,48h提取蛋白,实时荧光定量PCR检测各基因mRNA的表达情况,Western印迹检测SCP2蛋白表达情况。结果：(1)成功构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体；(2)与对照组比较,在小鼠Hepal-6细胞中SCP2mRNA表达上调约170倍(t=96.91,p<0.05)；SCP2蛋白表达增加约9倍(t=88.73,p<0.05),差异有统计学意义。(3)当SCP2基因过表达时,CYP7al基因表达下调2倍(t=3.97, p<0.05), HMGCR基因表达上调2倍,(t=3.23,p<0.05),差异有统计学意义。结论：我们成功构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体。当SCP2基因过表达时引起HMGCR和CYP7al基因的转录水平的变化,提示SCP2基因可能通过影响胆固醇和胆汁酸的代谢而参与胆固醇结石的形成。二、小鼠SCP2基因shRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定目的：构建小鼠SCP2基因shRNA重组腺病毒载体,进一步研究SCP2基因与胆囊胆固醇结石形成机制。方法：(1)两步PCR法合成针对小鼠SCP2基因shRNA,并连接到质粒PDC312上；(2)采用AdMax TM Adenoviru5Vector系统包装病毒,CsCl法纯化病毒、TCID50法测定滴度；(3) Western印迹检测SCP2蛋白验证重组腺病毒沉默效果,RT-PCR检测重组腺病毒在小鼠hepa-1-6细胞中SCP2、HMGCR、 CYP7al基因mRNA的表达。结果：(1)构建的重组腺病毒载体感染小鼠hepa-1-6细胞,SCP2基因在mRNA和蛋白水平均下调。(2)与对照组Adssh相比较：Adshl tD1=9.056,p<0.05, Adsh2tD2=7.777, p<0.05,差异均有统计学意义；且Adsh1对SCP2mRNA抑制率为83.5%,Adsh2对SCP2mRNA的抑制率为71.6%。Adsh1和Adsh2均有沉默效果效,且前者抑制效果更好。(3)与对照相比,当SCP2基因低表达时,CYP7al mRNA表达升高约2倍(t=10.10, p<0.05), HMGCR mRNA表达下降2倍多(t=10.68,p<0.05),差异有统计学意义。结论：成功构建小鼠SCP2基因的shRNA重组腺病毒载体；SCP2低表达时可能影响HMGCoA还原酶和CYP7-a羟化酶的活性导致胆固醇代谢的变化,从而可能预防胆固醇结石的形成。三、SCP2影响胆固醇和胆汁酸代谢参与结石的形成目的：给C57BL/6小鼠尾静脉注射生理盐水、空病毒、SCP2基因高表达和低表达腺病毒载体,观察肝胆汁成分的变化情况,进一步来研究SCP2基因与胆固醇结石形成的机制。方法：(1)建立小鼠胆汁外引流模型：小鼠麻醉后,腹部切口寻找十二指肠壶腹部乳头,确定胆总管开口处,PE10(内径0.28mmm,外径0.64mmm)管从胆总管开口对侧穿破肠壁逆行插入胆总管,成功便有胆汁流出；(2)8周龄C57BL/6小鼠40只随机分四组,每组10只,雌雄各半,分别经尾静脉注射生理盐水、空病毒载体、SCP2高表达和SCP2低表达腺病毒载体；(3)3天后按照上述模型引流胆汁,按重量比计算每分钟每100g体重小鼠胆汁的体积为胆汁流率(ul/min/100g);(4)高效液相色谱法测定胆汁中胆固醇、磷脂和胆汁酸盐,计算成石指数(LI)；(5)实时定量PCR检测SCP2、HMGCR、ABCG5、ABCG8、 ABCB11、CYP7a1、PKC-β基因mRNA的相对表达情况。结果：生理盐水组和空病毒组比较无差异。与空病毒组比较,SCP2基因高表达组胆汁流率减小,胆汁中的胆固醇、磷脂及胆盐增加,成石指数大于1,p<0.05,差异有统计学意义；SCP2低表达组,胆汁流率增加,胆汁中的胆固醇、磷脂及胆盐减少,成石指数小于1,p<0.05,差异有统计学意义。与空病毒组比较,SCP2高表达组和SCP2低表达组,SCP2基因(?)nRNA表达水平分别升高约是对照组的4倍,降低约3倍,差异均有统计学意义(p<0.05)；HMGCR基因mRNA表达分别上调约2.5倍多,下调约对照组的2倍(p<0.05)；CYP7a1基因mRNA表达相应下调约2倍多,上调约2倍(p<0.05)；ABCG5基因表达分别上调约1.5倍(p>0.05),下调约1倍(p<0.05)；ABCG8基因(?)nRNA表达分别上调约1.5倍(p>0.05),下调约1倍(p>0.05)； ABCB11基因mRNA表达分别是约对照的1.7倍(p<0.05)和一半(p>0.05)。结论：SCP2基因过表达时,1)使得胆固醇的转运能力增加,转运到肝脏的胆固醇也相应增加；2)引起HMGCR酶的活性升高,肝脏合成胆固醇增加,致使分泌到胆汁中的胆固醇浓度增加；3)使ABCG5.ABCG8基因表达升高,引起胆汁中胆固醇的分泌增加；4)ABCB11表达升高可能由于反馈调节或补偿机制的存在而使胆汁中胆固醇和磷脂的分泌增加；5)导致CYP7a1酶活性降低,胆汁酸合成能力下降,胆固醇的排泄减少。这些因素的综合作用将导致胆汁中胆固醇的过饱和而易于结晶,最终有助于形成结石。然而,当用RNA干扰方法敲除SCP2基因时,这些因素则恰恰起到相反作用,从而能够预防胆固醇结石的形成。即SCP2基因表达变化时通过引起胆固醇和胆汁酸代谢的改变而参与胆固醇结石的形成。