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第一部分 NIPT在胎儿染色体异常中的应用研究研究目的:通过分析62780例孕妇NIPT产前筛查结果,进行了无创胎儿染色体数目及结构异常全基因组新型检测技术的探索。探讨利用孕妇血浆中cffDNA检测胎儿染色体数目及结构异常的新方法及评价其在临床上的应用价值。方法:选取自愿参与NIPT检测的单胎孕妇60961例,双胎孕妇1819例,经高通量测序和数据分析后,将NIPT筛查高风险的胎儿全部纳入实验组,包括13、18、21号染色体非整倍体高风险、胎儿性染色体非整倍体高风险、罕见染色体非整倍体高风险及存在基因组拷贝数异常的病例。经知情同意后通过介入性产前诊断技术,对NIPT产前筛查结果为胎儿染色体的数目异常及大片段结构异常,以染色体核型为金标准,NIPT产前筛查结果为基因组拷贝数变异,经染色体微阵列芯片（CMA）验证结果为依据。结果:1.共检测60961例单胎孕妇标本,检出13、18、21非整倍体高风险孕妇482例,其中368例接受胎儿染色体核型分析,确诊胎儿染色体异常311例,胎儿染色体正常57例;检出性染色体非整倍体高风险孕妇270例,其中138例接受胎儿染色体核型分析,确诊胎儿染色体异常79例,胎儿染色体正常59例;检出罕见染色体非整倍体高风险孕妇158例,其中94例接受胎儿染色体核型分析,确诊胎儿染色体异常8例,胎儿染色体正常86例。NIPT低风险孕妇中有3例非整倍体假阴性:2例21三体、1例18三体。2.共筛查出T21高风险孕妇301例,251例进行核型分析,其中确诊236例（内含6例嵌合型21三体,3例易位型21-三体）,假阳性15例,本研究中NIPT检测胎儿T21 的敏感度为 99.16%（97.00-99.90%）,特异度99.98%（99.96-99.99%）,阳性预测值94.02%（90.46-96.31%）,阴性预测值 100.00%（99.99-100.00%）;T18高风险孕妇127例,82例进行核型分析,其中确诊61例（内含2例嵌合型18三体）,假阳性21例,检测T18的敏感度为98.41%（91.47-99.96%）,特异度99.97%（99.95-99.98%）,阳性预测值 74.70%（65.79-81.93%）,阴性预测值100.00%（99.99-100.00%）;T13高风险孕妇54例,35例进行核型分析,确诊14例,假阳性21例,检测T13的敏感度为100%（76.84-100.00%）,特异度99.97%（99.95-99.98%）,阳性预测值40.00%（65.79-81.93%）,阴性预测值 100.00%。3.共筛查出45,X高风险孕妇120例,58例进行核型分析,其中确诊18例,假阳性40例,NIPT筛查45,X的敏感度为100%,特异度99.93%,阳性预测值31.03%,阴性预测值100.00%。47,XXX高风险孕妇62例,35例进行核型分析,其中确诊22例,假阳性13例,47,XXX敏感度为100.00%,特异度99.98%,阳性预测值62.86%,阴性预测值100.00%。47,XXY高风险孕妇48例,28例进行核型分析,确诊24例,假阳性4例,47,XXY敏感度为100.00%,特异度99.99%,阳性预测值85.71%,阴性预测值100.00%。47,XYY高风险孕妇40例,17例进行核型分析,确诊15例,假阳性2例,47,XYY敏感度为100.00%,特异度100%,阳性预测值85.24%,阴性预测值100.00%。4.检出罕见染色体非整倍体高风险孕妇158例,95例进行核型分析,其中87例胎儿染色体正常,另外8例确诊为胎儿染色体异常,胎儿染色体非整倍体异常8 例为:47,XN,+2[7]/46,XN[43]、47,XN,+5[25]/46,XN[25]、47,XN,+15[4]/46,XN[46]、47,XN,+22[10]/46,XN[40]、47,XN,+16[2]/46,XN[74]、47,XN,+16[2]/46,XN[98]、47,XN,+9[10]/46,XN[40]、47,XN,+9[11]/46,XN[39]。5.染色体结构异常及基因组拷贝数变异高风险133例,其中72例在我院接受胎儿染色体核型及CMA分析,确诊胎儿染色体结构异常及基因组拷贝数变异34例,胎儿染色体结构正常及基因组拷贝数正常38例。检出染色体缺失及重复不平衡易位1例,16号染色体部分三体1例、两例Emanuel综合征等,漏诊两例胎儿,1例为22q13.3区域发生4.03Mb片段缺失的Phelan—McDermid综合征（Phelan-McDermid syndrome,PMDS,OMIM 606232）,另 1例为Xp22.33拟常染色体区均存在857kb杂合缺失。6.共检测1819例双胎孕妇标本,检出高风险孕妇13例。10例进行核型分析,21三体高风险5例均为一胎21三体,另一胎核型正常,18三体高风险3例,确诊2例,XXX高风险1例,确诊一胎为47,XXX,另一胎核型正常。NIPT结果提示染色体13q14.3-q21.1存在6.19Mb缺失结构异常高风险1例,3号染色体长臂3.06Mb的母体CNV导致了 NIPT结果的假阳性。结论:1.NTPT共检测62780例孕妇标本,其中单胎孕妇60961例,双胎孕妇1819例。我们研究结果表明NIPT使98.3%（61724/62780）的孕妇避免了不必要的有创性产前诊断操作,减少了受检者的经济负担和不必要的心理压力。2.NIPT对于T13、T18、T21敏感性及特异性均高于98%,T21、T18、T13的阳性预测值分别为94.02%、74.70%、40.00%,NIPT会导致假阳性及假阴性结果的出现,其阳性结果仍需要有创产前诊断确证胎儿核型。3.NIPT技术虽然可以检测出性染色体的异常,但对于45,X 阳性预测值较低。NIPT的筛查范围可以扩大至性染色体非整倍体,但出现假阳性的可能性增加,特别是Turner综合征,必须行有创产前诊断确诊。4.60961例中仅仅检测到8例罕见的嵌合型的常染色体三体患者,由于一些罕见的染色体嵌合的核型、程度、范围各异,没有固定的答案可循。NIPT—般不建议NIPT用于筛查13、18、21号染色体以外的罕见的常染色体非整倍体,NIPT扩大到检测罕见的非整倍体时,应向患者解释假阳性的可能,同时进行B超检测及有创的产前诊断来进一步诊断。5.NIPT检测胎儿染色体大片段结构异常及微缺失微重复具有可行性,cffDNA筛查可能有助于识别胎儿的缺失和重复,在某些情况下可能表明父母是平衡易位携带者的风险,从而为怀孕夫妇提供了明确的产前诊断和遗传咨询。对有异常临床表型的孕妇,在行NIPT检测出现阳性结果时,应首先排除孕妇本人遗传背景的影响。若证实其为母源因素造成的假阳性,也不应轻易放弃对其深入的分析,对这些遗传因素的深入分析,有助于NIPT检测在染色体微小结构异常的结果分析。6.NIPT用于双胎孕妇的筛查具有良好的检测效率,21三体检出率和特异性均为100%,虽然不能通过NIPT来判断异常胎儿的个数和位置,但是可以避免98%以上的双胎孕妇进行羊水穿刺带来的痛苦和流产风险。双胎NIPT研究报道数量少,样本量有限,双胎NIPT检测仍需要更多的研究进行论证。7.NIPT检测具有高敏感性和高特异性,但由于这项技术只能用于筛查而不是对胎儿核型的诊断,NIPT高风险孕妇仍需要通过有创产前诊断确诊。第二部分 GUCY2D基因突变功能研究研究目的:Leber先天性黑蒙症（Leber’s congenital amaurosis,LCA）是常染色体隐性遗传病,可导致婴儿在出生后不久完全丧失视力并伴有一系列严重并发症。通过二代测序及Sanger测序技术,在先证者家系中检测GUCY2D基因发现三个临床意义未明突变 c.139139delC（Ala49Profs*36）、c.2783G>A（Gly928Glu）和 c.835G>A（Asp279Asn）。经查阅数据库及文献,这三个突变属于新发突变无相关数据库及文献报道。采用SIFT、Polyphen-2和Mutation Tasting三个工具软件预测分析,其结果都是有害致病突变。对这三个突变的细胞生物学和功能研究将为LCA致病机制的探索提供理论依据。方法和结果:采用UCSF Chimera软件对野生型及突变型蛋白Gly928三级结构进行分析,结果提示Gly928突变造成催化功能降低。构建野生型及突变型Ala49Profs*36、Asp279Asn和Gly928Glu与绿色荧光蛋白EGFP融合表达载体,荧光共聚焦显微镜观察Ala49Profs*36荧光信号弱,提示蛋白降解。Asp279Asn和Gly928Glu经HPLC-MS/MS分析,发现其cGMP均降低,提示突变改变了酶活性。结论:通过荧光共聚焦显微镜观察和HPLC-MS/MS分析,分别证实Ala49Profs*36、Asp279Asn和Gly928Glu为GCUCY2D基因致病突变。本研究是在二代高通量测序基础上,对GUCY2D基因发现的三个新突变位点开展的功能研究,不仅能明确患者致病基因、致病突变及其功能影响,还能丰富疾病表型谱和突变谱,为研究GUCY2D基因致病机制提供理论依据,对遗传咨询、基因诊断、产前诊断、植入前遗传学诊断等临床遗传学服务具有重要应用价值。研究证实二代测序技术在遗传病的诊断中有极大的应用价值,致病性突变功能研究为疾病致病机制的研究提供了理论依据。