背景和目的终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)已成为21世纪全人类面临的主要公共健康问题之一。腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)是终末期肾脏病有效的治疗方法,具有保护残余肾功能、花费相对血液透析低等优势。但由于腹膜透析的并发症,如腹膜炎、营养不良、腹膜超滤衰竭,尤其透龄4-5年的患者,腹膜超滤衰竭发生率高达36%,已经成为腹膜透析患者被迫退出腹透的主要原因之一,因此探讨并干预腹膜透析超滤衰竭的发生与发展非常重要。目前认为超滤衰竭的发病机制主要有三方面的因素：1、腹膜血管表面积的不断增加：约50%到75%的超滤衰竭是由于腹膜血管新生导致腹膜血管表面积的不断增加,使得小分子溶质转运加快致腹腔渗透压递度迅速消失,使腹膜超滤功能丧失；2、因为水通道蛋白失功能；3、腹膜间质/淋巴系统吸收增加。腹膜血管新生可能是超滤衰竭发生的主要机制,调节血管新生的诱导剂有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,)等其它可溶性因子；抑制剂包括血管新生抑制素、内皮细胞抑制素(endostain, ES)等。目前认为血管生成时受到诱导因子和抑制因子的双重调节,正常情况下处于平衡状态,一旦诱导剂占优势,则激活血管长出新生血管,反之则使血管硬化。长期行腹膜透析的病人在其腹膜透析液中发现一些血管诱导剂增加,如VEGF、bFGF等,而且目前公认为血管内皮生长因子在腹透失超滤的发病机制中,是促进血管新生的主要因子,在血管新生中居于主导地位,并发现它在腹膜毛细血管内皮细胞和腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells, PMc)有阳性表达,但这些导致血管新生的因子表达增加的具体机制目前仍不清楚。综上所述我们有必要探讨腹膜血管新生在腹透失超滤发生机制所起的作用并进行干预研究,以便为延缓腹透失超滤的发生提供理论根据和实验依据,从而为多环节防治腹膜透析超滤衰竭的发生发展提供有效的治疗手段。因此本研究共分三部分：第一部分腹膜血管新生引起腹膜超滤衰竭的动物实验研究构建5/6肾切除尿毒症大鼠模型,进而构建尿毒症腹膜透析大鼠模型。检测大鼠腹膜组织VEGF、bFGF及ES基因和蛋白质水平的表达变化,以及检测腹膜组织毛细血管密度(MVD),探讨腹膜新生血管引起大鼠腹膜透析超滤衰竭的机制,为了下一步干预实验打好理论基础。第二部分腹膜血管新生引起腹膜超滤衰竭的临床研究留取正常对照者(取自非尿毒症的腹部择期手术患者,排除任何可累及腹膜的疾病)、尿毒症非透析患者(尿毒症患者首次腹透置管时)以及腹透超滤衰竭患者(尿毒症患者拔出腹透管时)的腹膜活检标本。检测血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子和内皮抑素基因和蛋白质水平的表达,检测腹膜组织毛细血管密度。为下一步干预腹膜透析超滤衰竭的研究奠定理论基础。第三部分重组人内皮抑素(恩度)干预腹膜血管新生的动物实验研究应用重组人内皮抑素(恩度),干预大鼠腹膜透析腹膜血管新生,从而起到抑制腹膜血管新生,干预腹膜透析超滤衰竭的作用,为下一步治疗临床腹膜透析患者超滤衰竭提供实验根据。第一部分腹膜血管新生引起腹膜超滤衰竭的动物实验研究一.资料与方法SD雄性大鼠42只,体重180-200g。构建5/6肾切除尿毒症大鼠模型,进而构建尿毒症腹膜透析大鼠模型。实验设立正常组(n=8只),手术组三组：尿毒症组(n=8只)、1.5%腹膜透析组(n=8只)、4.25%腹膜透析组(n=8只)。对各透析组大鼠进行规律腹透,每日每只20ml腹透液从大鼠颈部腹透管注入,腹腔保留2h后放出液体,规律透析28天后,取各组大鼠新鲜腹膜组织分别做逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及组织免疫组化,检测VEGF、bFGF及ES基因和蛋白质水平的表达变化,以CD34染色检测腹膜组织毛细血管密度(MVD),并进行统计学比较和基因水平的相关性分析,选取a=0.05作为差异具有统计学意义的检验水准。二.结果1. VEGF、bFGF及ES在正常大鼠腹膜组织中呈阳性表达。2.与正常组相比较,尿毒症组、1.5%腹膜透析组、4.25%腹膜透析组,VEGF、bFGF在基因及蛋白的表达水平均升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.正常组、尿毒症组、1.5%腹膜透析组及4.25%腹膜透析组大鼠腹膜组织中均有ES mRNA表达。其中正常组为0.47±0.05；尿毒症组为0.45±0.04；1.5%腹膜透析组为0.46±0.04；4.25%腹膜透析组为0.47±0.03；各组间表达差异无统计学意义(P>0.05)。4.正常组大鼠腹膜组织中ES蛋白表达积分0分；尿毒症组大鼠腹膜组织中积分2分；1.5%腹膜透析组大鼠腹膜组织中积分4分；4.25%腹膜透析组大鼠腹膜组织中呈高表达,积分9分。5.与正常组相比较,尿毒症组、1.5%腹膜透析组、4.25%腹膜透析组大鼠腹膜组织中MVD的表达均增高,组间差异均有统计学意义(p<0.05)。第二部分腹膜血管新生引起腹膜超滤衰竭的临床研究一.资料与方法留取正常对照者、尿毒症非透析患者以及腹透超滤衰竭患者的腹膜活检标本。将所留取的腹膜标本分别行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和组织免疫组化染色,检测血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子和内皮抑素基因和蛋白质水平的表达。行CD34染色,计数腹膜组织毛细血管密度。二.结果1. VEGF、bFGF及ES的mRNA在各组人腹膜组织均有表达。与正常相比较,尿毒症非透析组、PD组腹膜组织VEGF、bFGF mRNA表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)；与尿毒症非透析组相比较,PD组腹膜组织VEGF、bFGF mRNA表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。ES mRNA各组表达无差异。2.各组腹膜组织均表达VEGF、bFGF及ES。与正常相比较,尿毒症非透析组、PD组腹膜组织VEGF、bFGF、ES蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)；与尿毒症非透析组相比较,PD组腹膜组织VEGF、bFGF、ES蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.MVD计数结果在正常组可见新生毛细血管较少或无,与正常组相比较,尿毒症非透析组、腹膜透析超滤衰竭组人腹膜组织MVD计数增加(P<0.05),差异具有统计学意义。第三部分重组人内皮抑素(恩度)干预腹膜血管新生的动物实验研究一.资料与方法清洁级雄性SD大鼠43只,体质量为180-200g。构建5/6肾切除尿毒症大鼠模型,进一步构建尿毒症腹膜透析大鼠模型。实验分为A：对照组(正常组：n=8只),B：尿毒症非透析组(5/6肾切除组：n=8只)、C：尿毒症腹膜透析组(生理盐水对照组：n=8只)、D1：重组人内皮抑素治疗1组(10mg/kg治疗组：n=8只),D2：重组人内皮抑素治疗2组(40mg/kg治疗组：n=8只)。对C、D1、D2组大鼠进行规律腹透,每日4.25%的腹透液从大鼠颈部腹透管注入,腹腔保留2h后放出液体,规律透析28天。D1、D2组(重组人内皮抑素治疗1、2组)在规律腹透期间,隔天皮下注射重组人内皮抑素,连续给药14次,直至腹透第28天结束,留取各组大鼠新鲜腹膜组织,采用免疫组织化学及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测腹膜组织VEGF基因及蛋白水平的表达,用CD34染色观察各组大鼠腹膜血管数并计算腹膜组织毛细血管密度(Microvessel Density, MVD),所得结果进行统计学分析,选取α=0.05作为差异具有统计学意义的检验水准。二.结果1.与正常组相比较,尿毒症组、尿毒症腹膜透析组,VEGF基因及蛋白水平的表达均升高(p<0.05),差异具有统计学意义。与尿毒症腹膜透析组相比较,重组人内皮抑素治疗1组、重组人内皮抑素治疗2组,VEGF基因及蛋白水平的表达均降低(p<0.05),差异具有统计学意义。与重组人内皮抑素治疗1组相比较,重组人内皮抑素治疗2组,VEGF-A基因及蛋白水平的表达均降低(p<0.05),差异具有统计学意义。2.与正常组相比较,尿毒症组、尿毒症腹膜透析组,MVD的值均增加(p<0.05),差异具有统计学意义。与尿毒症腹膜透析组相比较,重组人内皮抑素治疗1组、重组人内皮抑素治疗2组,MVD的值均降低(p<0.05),差异具有统计学意义。与重组人内皮抑素治疗1组相比较,重组人内皮抑素治疗2组,MVD的值降低(p<0.05),差异具有统计学意义。3. VEGF基因水平的表达与MVD值呈现正相关,VEGF和尿毒症长期腹透时腹膜血管新生相关。结论1.大鼠和人的腹膜组织均表达VEGF、bFGF及ES,体内尿毒症环境和非生理性腹透液的刺激可以上调腹膜组织VEGF、bFGF基因和蛋白的表达。2.尿毒症腹膜透析大鼠和人腹膜组织VEGF、bFGF基因及蛋白水平表达升高,可能在长期透析所致腹膜组织新生毛细血管形成过程中发挥一定的促血管新生作用,是腹透失超滤发生的重要因素之一。3.体内尿毒症毒素和非生理性腹透液刺激可使大鼠和人的腹膜组织ES蛋白表达升高,在长期透析所致腹膜组织毛细血管生成增多中可能发挥一定的抑制血管生成作用。4.重组人内皮抑素(恩度)能抑制尿毒症腹膜透析大鼠腹膜新生血管的形成,并且其抑制作用的强弱与药物的剂量有关。5.重组人内皮抑素(恩度)可能是通过下调尿毒症腹膜透析大鼠腹膜组织中VEGF的表达而发挥抑制腹膜新生血管形成的作用。