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寒冷是北方常见的应激原。冷应激会导致动物免疫性能下降,也会延缓动物的生长,降低动物的生殖能力,是制约我国畜牧业发展的重要因素。肺脏是呼吸系统最重要的器官,其内由数以亿计的肺泡。肺泡是气体交换的主要场所,能够与冷空气直接接触,造成肺脏发生应激反应。已有的研究表明,Shh信号通路胚胎肺脏的发育中发挥重要作用,并且参与肺脏疾病的调控。那么,冷暴露状态下,肺脏组织及肺泡细胞的损伤机制是怎样的呢?因此,本研究以首次构建小鼠慢性冷暴露肺损伤模型,旨在研究慢性冷暴露对小鼠肺脏的损伤的影响,并以Shh信号通路为切入点,探讨其在冷暴露状态下对肺损伤的保护机制。为探究慢性冷暴露对小鼠肺损伤的影响,将5周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为冷暴露组（Cold exposure,CE）和室温对照组（Room temperature,RT）。冷暴露组小鼠每天随机时间在4℃环境中刺激3 h,共刺激3 w。室温对照组小鼠于24±2℃环境中饲养。为了研究慢性冷暴露对小鼠肺脏氧化应激水平的影响,使用酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）检测小鼠肺脏中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的水平和还原型谷胱甘肽（Reduced glutathione,GSH）的活性、荧光探针技术检测了小鼠肺脏中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的水平、使用Western Blot方法检测了热休克蛋白60（Heat shock protein 60,HSP60）、70、90、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S transferase,GST）、超氧化物歧化酶1（Superoxide dismutase 1,SOD-1）、核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf-2）、Kelch样Ech相关蛋白1（Kelch-like Ech-associated protein-1,Keap1）、血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）的表达水平。结果显示,与室温对照组相比,冷暴露组小鼠肺脏中MDA的水平上升（P<0.01）,GSH的活性下降（P<0.01）;此外,冷暴露组小鼠肺脏中ROS含量高于室温对照组,提示慢性冷暴露诱导了小鼠肺脏氧化应激。Western Blot结果显示氧化应激蛋白HSP60（P<0.01）、HSP70（P<0.05）、HSP90（P<0.05）、SOD-1（P<0.01）的表达水平上升,CAT（P<0.01）、GST（P<0.01）、Nrf-2（P<0.01）、Keap1（P<0.01）、HO-1（P<0.01）的表达水平下降,提示慢性冷暴露诱导了小鼠肺脏中应激相关蛋白质和脂质的氧化损伤,并降低了小鼠肺脏的抗氧化能力。为了研究慢性冷暴露对小鼠肺脏中炎症及凋亡的影响,使用HE染色和TUNEL染色观察了小鼠肺脏中炎症和凋亡的情况。结果表明,慢性冷暴露诱导了小鼠肺脏炎症,并提高了小鼠肺脏的凋亡水平。使用Western Blot方法检测小鼠肺脏中白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3）的表达水平。结果表明,与室温对照组相比,冷暴露组小鼠肺脏中IL-1β（P<0.01）、IL-6（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）、Bax（P<0.01）、Caspase3（P<0.01）的表达水平上升、Bcl-2（P<0.01）的表达水平下降,佐证了慢性冷暴露诱导小鼠肺脏炎症和凋亡,并提示慢性冷暴露降低了小鼠肺脏的抗凋亡能力。为了探究Shh信号通路在小鼠慢性冷暴露过程中的影响,使用Western Blot和IHC方法检测了小鼠肺脏中Sonic hedgehog蛋白（Shh）、Smoothened蛋白（Smo）、锌指转录因子胶质瘤相关致癌基因同源物1（Zinc finger transcription factor glioma-associated oncogene homolog 1,Gli1）、2、3的表达水平。结果表明,与室温对照组相比,小鼠肺脏中Shh（P<0.01）、Smo（P<0.01）、Gli1（P<0.05）、Gli2（P<0.01）、Gli3（P<0.01）表达水平下降,说明慢性冷暴露可抑制Shh信号通路的激活并抑制其作用。为进一步探索Shh信号通路在慢性冷暴露诱导的小鼠肺脏损伤的作用机制,本研究进行了体外实验,在32℃的条件下对小鼠II型肺泡上皮细胞MLE12进行亚低温处理3 h,用以模拟体内冷暴露环境,并分别用Shh重组蛋白（r Shh）、Shh信号通路抑制剂环巴胺（Cyclopamine,Cyc）、Gli抑制剂GANT58处理细胞。使用Western Blot方法检测MLE12细胞中氧化应激（Nrf-2、Keap1、HO-1）、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及凋亡因子（Bcl-2、Bax、Caspase3）相关蛋白的表达水平。结果表明,在32℃亚低温处理的条件下,r Shh处理显著升高了Nrf-2（P<0.01）、HO-1（P<0.01）、Bcl-2（P<0.01）的表达,降低了Keap1（P<0.01）、IL-1β（P<0.01）、IL-6（P<0.01）、TNF-α（P<0.01）、Bax（P<0.01）、Caspase3（P<0.01）的表达;而Cyc及GANT58的预处理则减弱了由r Shh对MLE12细胞氧化应激、炎症因子及凋亡因子升高或降低的效应。以上结果提示,在32℃亚低温处理的条件下,Shh信号通路的激活能够提高MLE12细胞的抗氧化能力,并降低炎症和凋亡的水平。相反,抑制其信号通路的激活则加重了亚低温条件下的MLE12细胞的损伤作用。结论:慢性冷暴露能够诱导小鼠肺脏氧化应激、炎症和凋亡,并抑制Shh信号通路的表达。Shh信号通路的激活能够缓解亚低温诱导的MLE12细胞氧化应激、炎症和凋亡。