FGF21（Fibroblast growth factor 21）是成纤维细胞生长因子家族的一个重要成员,具有显著的降血糖降血脂功效,是一种极具应用前景的治疗Ⅱ型糖尿病候选药物。然而,反复注射FGF21会增加患者的痛苦,为患者及其家庭甚至社会带来了沉重负担。为了开发出FGF21的口服制剂,本课题选用蛹虫草菌丝体为生物反应器高效表达人FGF21,通过体外和体内试验深入研究转hFGF21重组蛹虫草菌丝体的降糖降脂作用。1. 以GPD为真菌特异性启动子,以潮霉素为抗性筛选标记,利用PEG介导的遗传转化技术,将真菌特异性表达重组载体pCB130-hFGF21转化至蛹虫草原生质体中,分别考察350、400、450、500和550 mg/L潮霉素对蛹虫草菌丝体生长的影响,结果显示450 mg/L潮霉素为筛选的临界浓度。进一步通过基因组PCR、SDS-PAGE和Western blot等方法进行检测,最终获得了8株含有目的基因hFGF21的阳性菌丝体转化子,其转化率为12.3%,并将表达量最高的菌株命名为X06-49。2. 为了考察hFGF21在蛹虫草菌丝体的生长过程中的表达变化以及遗传稳定性,利用摇瓶发酵培养菌株X06-49,通过ELISA法检测菌株X06-49中的hFGF21含量,结果表明,最佳培养时间为7天,hFGF21含量为1.8 mg/g菌丝体;进一步将菌株X06-49摇瓶连续传代培养11代,通过ELISA法检测每一代菌丝体中hFGF21的含量,结果表明,转hFGF21重组蛹虫草菌株可稳定遗传至第7代,具有较好的遗传稳定性。3. 为了检测rhFGF21的体外活性,利用Ni-NTA镍离子亲和层析柱对含有组氨酸标签的rhFGF21进行纯化,并采用葡萄糖氧化酶和过氧化物酶法检测rhFGF21对小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞（3T3-L1）的葡萄糖吸收活性。结果显示,与市售的FGF21相似,rhFGF21可促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收作用,且具有剂量依赖性。进一步通过检测ERK代谢通路相关指标的表达变化,表明rhFGF21是与FGFR结合后通过激活ERK途径下游相关蛋白的磷酸化,进而发挥其对3T3-L1细胞的葡萄糖吸收作用。此外,将菌株X06-49和市售FGF21分别置于-20°C、4°C和37°C条件下储存24个月后,进行活性检测,结果表明重组蛹虫草中rh FGF21的相对活性分别为95%、80%和48%,明显优于市售FGF21干粉,说明蛹虫草菌丝体作为宿主具有保护rhFGF21活性的作用。4. 为了考察口服转h FGF21的重组蛹虫草菌丝体对Ⅱ型糖尿病的降糖和降脂作用,将db/db小鼠连续口服蛹虫草菌丝体60天,通过血糖检测、空腹血糖IGTT试验、胰岛素含量以及血脂含量检测,结果表明口服重组蛹虫草菌丝体可以有效降低db/db小鼠的血糖水平,增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗。显著降低（P<0.01）血液中甘油三脂（TG）、总胆固醇（T-CHO）、游离脂肪酸（NEFA）,低密度脂蛋白（LDL-C）的浓度,显著提高高密度脂蛋白（HDL-C）的浓度（P<0.01）,有效缓解糖尿病小鼠的血脂代谢紊乱。5. 为了考察口服转hFGF21蛹虫草菌丝体对db/db小鼠脂肪肝和胰腺的作用,分别检测db/db小鼠血清ALT和AST的含量,并通过荧光定量PCR技术检测脂肪肝相关炎症因子MCP-1、Cd11b、F4/80、CD68和TNF-a的mRNA表达水平变化,并观察脂肪肝组织的组织病理切片。结果显示,口服转hFGF21蛹虫草菌丝体显著降低db/db小鼠血液ALT和AST的含量（P<0.01）,显著降低脂肪肝炎症因子相关基因的表达（P<0.01）,明显减少db/db小鼠的脂肪肝中的脂肪颗粒数量。同时以细胞凋亡执行蛋白Caspase 3为检测指标进行胰腺组织免疫组化分析,结果显示口服转hFGF21蛹虫草菌丝体可以通过降低胰岛β细胞的凋亡来保护胰腺组织。6. 为了评估转hFGF21蛹虫草菌丝体的安全性,进行急性毒性和亚急性毒性试验。急性毒性试验证实,最大给药量为15 g·kg^-1/d时未见死亡现象。亚急性毒性试验中,大鼠分高(10.5 g·kg^-1/d)、中(1.05 g·kg^-1/d)、低(0.35 g·kg^-1/d)剂量给药28天,结果表明,口服中低剂量的重组蛹虫草菌丝体并未显著改变大鼠体重、各器官脏器比、血液学指标和血液生化指标,各个脏器的组织病理学切片结果中也未见有组织形态学的改变。初步证明转hFGF21蛹虫草菌丝体作为口服制剂安全无毒。