论文部分内容阅读
背景及目的阿尔茨海默病的病因致病机制是多因素的,Aβ和tau蛋白异常聚集是AD发病的核心因素,氧化应激和神经炎症促进AD发病与发展,目前研究表明micro RNAs参与了这些致病机制的调控。micro RNA-592(miRNA-592)在介导神经细胞的活动中发挥重要作用,但其与AD的关系尚不清楚。本研究通过建立的AD大鼠模型及原代星形胶质细胞实验探讨miRNA-592在星形胶质细胞氧化应激损伤中的作用机制,旨在为AD的治疗提供理论依据。方法动物实验:(1)实验动物SD大鼠54只,2月龄,体重264.80±26.80 g,分为对照组(n=26)、AD组(n=28)。(2)建立AD模型通过给SD大鼠皮下注射D-半乳糖和双侧海马注射Aβ25-35制备AD大鼠模型,应用Morris水迷宫试验评价建立的AD模型大鼠可靠性。(3)刚果红、苏木精和伊红(HE)染色观察对照组和AD模型大鼠海马组织CA1区的病理变化。(4)AD模型诱导成功后,ELISA方法测定实验大鼠血清氧化应激标志物活性。(5)RT-q PCR检测实验大鼠脑组织miRNAs、KIAA0319 m RNA变化;(6)Western blot分析实验大鼠脑组织Aβ、tau蛋白表达。细胞实验:(1)从AD模型大鼠脑组织提取、分离、培养星形胶质细胞(astrocyte,AST),用免疫细胞化学和GFAP、DAPI免疫荧光染色鉴定ASTs,并进行纯度测定;倒置荧光显微镜下观察ASTs形态与结构变化。(2)生物信息分析结合双荧光素酶报告基因实验探讨miRNA-592与KIAA0319基因的关系;(3)构建p GL3 KIAA0319 Wt(野生型荧光素酶报告基因质粒)、miRNA-592NC(miRNA-592阴性对照),p GL3 KIAA0319 Wt、miRNA-592 mimic(miRNA-592模拟组),p GL3 KIAA0319 Mut(突变体的荧光素酶报告基因质粒)、miRNA-592 NC,p GL3 KIAA0319 Mut、miRNA-592 mimic,重组质粒以不同组合转染ASTs,验证KIAA0319是否为miRNA-592的靶基因;(4)应用报告基因载体构建miRNA-592、si RNA-KIAA0319质粒,miRNA-592抑制剂+si RNA-KIAA0319质粒转染ASTs,实验设置了模拟阴性对照(mimic NC)、抑制阴性对照(inhibitor NC)及空白对照组(Blank);(5)通过MTT法检测各组ASTs细胞活力;用全波长荧光型酶标仪(Spectra Max Gemini EM,Molecular Devices)检测各组OS活性水平;(6)RT-q PCR检测各组转染ASTs的miRNA-592、KIAA0319、Keap1、Nrf2和NQO1的m RNA水平;Western blot实验分析各组的KIAA0319、C-Keap1、N-Nrf2、T-Nrf2和NQO1蛋白表达。结果动物实验结果:(1)Morris水迷宫实验:对皮下注射D-半乳糖和海马注射Aβ25-35联合诱导的AD大鼠进行行为与学习记忆能力评价,Morris水迷宫结果发现大鼠逃逸潜伏期和游泳距离在第二天最长(P>0.05),随着训练天数的增加,逃逸潜伏期和游泳距离逐渐缩短;第3天起,AD组大鼠的逃逸潜伏期和游泳距离明显长于对照组(P<0.05)。在第7天的空间探索试验中,与对照组相比,AD组大鼠初次到达目标区域的时间延长,在目标区域的停留时间缩短,穿越目标区域的次数减少(P<0.05)。(2)对照组和AD大鼠血清ACh E、MAO、MDA、TNF-α、IL-6及SOD测定结果表明AD组大鼠血清中ACh E、MAO、MDA和IL-6水平明显高于对照组(P<0.05),血清SOD水平显著降低(P<0.05),而两组间TNF-α水平无显著性差异(P>0.05)。(3)大鼠脑组织HE染色:AD组大鼠海马CA1区细胞界限不清,缩小,胞浆呈浅红色,细胞核呈暗色和固缩核;而对照组大鼠海马CA1区细胞排列有序,密集,细胞边界清楚,细胞核和细胞质清晰。刚果红色染色:在AD组中,染色沉积物大多分布在海马,大小和染色不同,底色是棕红色,而染色颜色接近红色;大多数细胞是圆形的,不规则且排列紊乱;对照组海马细胞边界清晰,核仁明显,无明显沉积物。(4)RT-q PCR:AD大鼠脑中miRNA-132-3p、miRNA-129-5p和miRNA-136-5p的表达无变化,而miRNA-592的表达明显上调;m RNA-KIAA0319在AD模型大鼠中的表达水平相对较低。(5)Western blot:AD大鼠脑组织Aβ、T-tau、p-tau蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。细胞实验结果:(1)细胞形态学观察及鉴定倒置显微镜下观察实验大鼠细胞免疫细胞化学染色,显示AD组大部分细胞质突起呈棕色,颜色深浅不一,细胞边界清晰,细胞形态多样,突起的数量和长度有显著不同,高倍镜下,细胞体和突起呈纤维样褐色染色;对照组仅细胞核着色,胞浆无褐色染色。对培养的细胞进行免疫荧光共染色鉴定,荧光显微镜下观察,GFAP染色(+)和DAPI染色(+)的分别是绿色的胞质与突起和蓝色核的ASTs,经计数纯度达到95%以上;倒置显微镜下观察第6天至第14天的ASTs形态相似,呈扁平和多角形,胞浆丰富,核圆形或椭圆形,第16天后,大多数ASTs为成熟阶段的细胞,部分表现为肥大和增生。(2)构建p GL3 KIAA0319 Wt(野生型荧光素酶报告基因质粒)、miRNA-592 NC(miRNA-592阴性对照),p GL3 KIAA0319 Wt、miRNA-592 mimic(miRNA-592模拟组),p GL3 KIAA0319 Mut(突变体的荧光素酶报告基因质粒)、miRNA-592 NC,p GL3 KIAA0319 Mut、miRNA-592mimic,重组质粒转染ASTs并进行双荧光素酶报告基因分析,结果表明,miRNA-592 mimic对p GL3 KIAA0319 Mut荧光素酶活性无显著影响(P>0.05),而miRNA-592 mimic对p GL3 KIAA0319 Wt荧光素酶活性下调约53%(P<0.05),说明miRNA-592与KIAA0319有结合,KIAA0319是miRNA-592的靶基因。(3)MTT实验表明,与对照组比较,miRNA-592模拟组和si KIAA0319组ASTs细胞活力明显降低(P<0.05),而miRNA-592抑制剂组ASTs细胞活力增强(P<0.05)。模拟NC组、抑制剂NC组和miRNA-592抑制剂+si KIAA0319组细胞活性无显着性差异(P>0.05);Gemini EM检测显示,与空白对照组比较,模拟miRNA-592和si KIAA0319组的SOD、CAT和GSH水平均显著降低,而MDA和ROS水平升高(P<0.05);miRNA-592抑制剂组呈现相反的趋势(P<0.05);模拟NC组、抑制剂NC组和miRNA-592抑制剂+si KIAA0319组之间无显著差异(P>0.05)。(4)RT-q PCR结果表明,与空白对照组相比,miRNA-592模拟+si KIAA0319组中,miRNA-592和Keap1的表达增强,KIAA0319、Nrf2和NQO1的表达显著降低,而miRNA-592抑制剂组呈相反趋势(均P<0.05);模拟NC组、抑制剂NC组、miRNA-592抑制剂+si KIAA0319和空白对照组中miRNA-592、KIAA0319、Keap1、Nrf2和NQO1的表达均无显着性差异(P>0.05)。(5)Western blot分析显示,与空白对照组相比,miRNA-592模拟+si KIAA0319组中C-Keap1的表达增加,KIAA0319、N-Nrf2和NQO1的表达降低;相对于空白组,miRNA-592抑制剂组C-Keap1的表达降低,KIAA0319、N-Nrf2和NQO1的表达增强(P<0.05)。模拟NC组、抑制剂NC组、抑制剂+si KIAA0319组与空白对照组之间的KIAA0319、C-Keap1、N-Nrf2、T-Nrf2、NQO1差异均无统计学意义(P>0.05)。结论(1)皮下注射D-半乳糖联合海马注射Aβ25-35联合诱导的AD大鼠模型是可靠的;脑组织Aβ、T-tau和P-tau蛋白表达增加,CA1区有AD的病理性改变。(2)动物实验结果表明AD大鼠存在氧化应激损伤,脑组织存在miRNAs表达异常,即miRNA-592高表达,而KIAA0319为低表达。(3)细胞实验结果显示下调miRNA-592可以通过激活Keap1/nrf2/ARE信号通路减轻AD大鼠ASTs的OS损伤,其作用机制可能是上调KIAA0319表达,即下调miRNA-592可以通过上调KIAA0319表达激活Keap1/nrf2/ARE信号通路抑制AD大鼠ASTs氧化应激损伤。