光果甘草叶黄酮的分离纯化、活性研究及应用

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甘草是一种药食同源的草本植物,广泛用于中药处方与食品工业中。现今使用的甘草主要为其根与根状茎,而地上部分却作为畜牧饲料或燃料低值化处理。目前关于甘草根及根状茎的成分及生理活性研究已相当充分,而对甘草地上部分却研究较少。本论文通过对比分析光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)叶与根中物质组成和生理活性,确定光果甘草叶的研究价值;通过色谱分离和光谱技术分离并鉴定了光果甘草叶中的黄酮并对其活性进行评价;优化了光果甘草叶黄酮的测定和提取方法,并通过大孔树脂对光果甘草叶黄酮进行富集研究;研究了光果甘草叶黄酮对猪肉及其制品储藏过程中油脂氧化和蛋白氧化的抑制作用,以期为甘草叶的高值利用提供理论指导。具体研究内容如下:(1)通过HPLC分析了光果甘草根、茎、叶乙醇-水溶液提取物中物质种类及含量的差异,对比了光果甘草叶和根乙醇-水溶液提取物的总黄酮含量、ORAC活性、DPPH自由基清除能力、亚硝酸盐清除能力和酪氨酸酶抑制活性,确定了光果甘草叶在黄酮含量和活性上的优势。二氢黄酮乔松素和甘草苷分别是光果甘草叶和根中主要黄酮类物质,活性评价结果表明乔松素具有比甘草苷更好的抗氧化能力和亚硝酸盐清除能力,但抑制酪氨酸酶活性的能力弱于甘草苷。细胞抗氧化实验结果表明,乔松素和甘草苷在低浓度(3.125μM)时对由H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤均表现出显著的保护作用,且高浓度的乔松素(≥100μM)能促进PC12细胞生长,而高浓度的甘草苷(≥100μM)则会对细胞产生毒性作用。(2)从光果甘草叶中分离鉴定出五种化学结构相近的黄酮包括:光甘草宁、乔松素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、乔松素、短叶松素和高良姜素;其中短叶松素为首次从甘草属植物(豆科植物)中分离得到;建立了通过聚酰胺树脂柱层析、醇溶水沉以及乙醇重结晶三步即得到高纯度乔松素的方法。通过荧光猝灭、酶活抑制、酶促动力学研究和分子模拟对接实验结果证明五种黄酮均能与黄嘌呤氧化酶结合,且结合位点不止一个;对黄嘌呤氧化酶活性抑制能力大小依次为:短叶松素>高良姜素>乔松素>乔松素-7-O-β-D-呋喃葡萄糖苷>光甘草宁,其中短叶松素、高良姜素和乔松素具有良好的黄嘌呤氧化酶抑制活性;高良姜素、短叶松素和乔松素都是黄嘌呤氧化酶的混合型抑制剂,三种黄酮抑制机制各不相同,与底物的种类和浓度相关;分子模拟对接结果表明高良姜素和短叶松素能嵌入黄嘌呤氧化酶的活性中心,并与活性中心附近的包括Ser-876,Asn-768,Glu-1261和Thr-1010在内的氨基酸残基形成氢键和π-π共轭作用,从而使黄酮-XOD结合体的稳定性增加。(3)优化出一种能快速准确测定光果甘草叶总黄酮的方法为:以槲皮素为对照品,三氯化铝显色法,检测波长为314 nm。在预实验基础上,选定乙醇为提取溶剂,采用超声辅助提取光果甘草叶黄酮,并以黄酮提取率和提取液的DPPH清除率为指标,采用响应面法优化出光果甘草叶黄酮的最优超声提取工艺。(4)研究了XAD-4、XAD-16、HP-2MGL、SP-825和SP-207五种不同物理化学性质的大孔树脂对光果甘草叶黄酮的吸附动力学和热力学行为。动力学实验结果表明五种树脂均能对甘草叶黄酮进行快速吸附,吸附行为以准二级动力学方程为最佳模型,且吸附过程由表面扩散和颗粒内扩散共同影响;而热力学实验结果表明Freundlich模型能更好评价XAD-16和SP-825大孔树脂对光果甘草叶黄酮的等温吸附行为,且吸附过程是放热的物理吸附。采用柱层析和乙醇梯度洗脱的方法研究了XAD-16和SP-825两种大孔树脂对光果甘草叶黄酮的富集效果,其中70%和90%乙醇洗脱组分的黄酮富集效果最佳;不同浓度乙醇的洗脱组分的抗氧化和亚硝酸盐清除能力之间具有明显的相关性,但均与组分中总黄酮和乔松素含量无关。(5)研究了乔松素和甘草叶黄酮的大孔树脂富集组分对猪肉及其制品储藏期间油脂氧化和蛋白氧化的抑制作用,结果表明:乔松素和甘草叶黄酮(XAD-16-50%组分)均能有效抑制猪肉糜/猪肉饼在冷藏(15天)/冻藏(60天)过程中发生的油脂氧化,其中甘草叶黄酮(XAD-16-50%组分)抑制效果优于乔松素,添加量为0.05%(w/w)即表现出与TBHQ(0.02%;w/w)相当的抑制作用,且不受温度影响;乔松素和甘草叶黄酮(XAD-16-50%组分)对肌原纤维蛋白氧化具有一定的抑制作用,但各剂量之间无显著的差异。本研究结果表明,乔松素和甘草叶黄酮(XAD-16-50%组分)对油脂氧化和蛋白氧化抑制作用之间无明显的相关性。通过GC-MS测定猪肉饼在储存期间风味物质含量的变化,结果表明乔松素和甘草叶黄酮(XAD-16-50%组分)能明显影响生熟猪肉饼冻藏过程中醛类、醇类、酯类和酮类等风味物质含量的变化。(6)使用油脂氧化稳定性分析仪评价了甘草叶黄酮XAD-16-30%、XAD-16-50%和XAD-16-70%三个乙醇洗脱组分对猪油氧化的抑制作用,表明其均能有效抑制猪油氧化且具有明显的量效关系;使用温度外推法实验结果表明添加0.05%(w/w)的甘草叶黄酮XAD-16-50%组分即能将猪油货架期(20℃条件下储存)延长15天。
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