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磷脂信号在植物生长发育和逆境应对方面都具有重要作用，因此磷脂信号通路一直是研究的热点。磷脂酶能够水解细胞膜上的磷脂，并产生一系列的信号分子，因此在磷脂信号通路中起着重要作用。磷脂酶按其水解磷脂的部位不同，可以分为磷脂酶A(phospholipase A，PLA)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、磷脂酶D(phospholipaseD，PLD)。其中植物磷脂酶C按其作用底物的不同可分为底物非特异性磷脂酶C(nonspecific phospholipase C，NPC)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC）。生物信息学的资料显示，水稻中存在4个PI-PLC，但作用机理尚不明确。本论文以水稻OsPLC1基因为研究对象，以实验室已鉴定出的水稻野生型（日本晴）和Tos17单拷贝插入的OsPLC1缺失突变体为材料，初步探究了水稻PI-PLC家族中OsPLC1的胞内定位情况及其对水解底物的情况。具体研究如下: 我们构建了OsPLC1自身启动子启动的GFP-OsPLC1表达载体，在烟草中表达ProPLC1∷GFP-OsPLC1融合蛋白，发现OsPLC1自身启动子启动的GFP-OsPLC1定位在质膜和靠近质膜的细胞质中，这与实验室之前研究的pSuper∷GFP-OsPLC1在烟草中的定位情况一致。随后为了进一步确定OsPLC1的定位情况，我们将两种启动子启动的GFP-OsPLC1永久表达载体通告转基因技术转入野生型中，结果只获得了稳定遗传的pSuper∷GFP-OsPLC1的转基因植株。随后用激光共聚焦观察转基因植株中OsPLC1的定位，得出了和烟草中同样的结论，即OsPLC1定位在质膜和靠近质膜的细胞质中。为了进一步验证OsPLC1的定位，我们用两相法分离转基因植株的细胞质膜和胞质，随后用GFP抗体进行蛋白免疫印迹试验，结果表明质膜和胞质中均存在GFP-OsPLC1。且当盐处理15min后，质膜GFP-OsPLC1明显增多，而胞质GFP-OsPLC1有所减少。因此我们推测正常生长情况下，OsPLC1主要存在于胞质中，而当植株受到盐胁迫后，胞质中的OsPLC1会迅速锚定在质膜，水解底物，从而参与盐胁迫响应。蛋白免疫印迹试验结果还显示，质膜GFP-OsPLC1分子量略大于胞质质膜GFP-OsPLC1，这可能与质膜上的OsPLC1被修饰有关。另外，我们试图通过酵母双杂技术筛选出与OsPLC1互作的蛋白，筛选得到了定位在胞质中的JOKA2，它是否与胞质中的OsPLC1行使功能有关，还需要进一步的验证。 在动物和植物经典研究中，PLC主要水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidyl-inositol4，5-bisphosphate，PtdIns(4，5)P2)。但是经研究发现，植物细胞中磷脂酰肌醇4-磷酸(phosphatidylinositol4-phosphate，PtdIns4P)含量远高于PtdIns(4，5)P2，并被推测它也有作为PLC底物的可能，但缺乏证据。本论文对OsPLC1的两个可能的水解底物PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2在体内的水解情况进行了初步研究。我们分别克隆了PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2的特异性结合片段PHFAPP1和PHPLCδ1，构建了Super启动的PHFAPP1-GFP和PHPLCδ1-GFP的永久表达载体，通过转基因技术将这两个永久表达载体分别转入水稻野生型(WT)和突变体(osplcl)中。首先观察两者在水稻中的定位，结果显示PHFAPP1和PHPLCδ1均主要定位在细胞质膜上，提示PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2主要分布在膜上，且PtdIns4P在水稻根部呈现极性分布。但是PHPLCδ1在胞质中也存在，这可能是因为细胞中的PtdIns(4，5)P2含量很低(van Leeuwen et al.，2007)，而过量的PHPLCδ1-GFP无法与PtdIns(4，5)P2结合，从而游离在细胞质中。随后以PHFAPP1-GFP在野生型和突变体中的转基因阳性植株为材料，利用激光共聚焦显微镜检测75 mM NaCl处理下，水稻主根中PtdIns4P含量的变化。实验结果发现，正常生长条件下，野生型PtdIns4P含量低于突变体，在盐处理后，野生型PtdIns4P含量存明显下降，突变体中PtdIns4P含量呈现略有上升的趋势。随后我们又利用薄层层析和气相色谱技术对150 mM NaCl处理前后野生型和突变体PtdIns4P含量进行测定。PtdIns4P含量变化趋势与之前使用探针相一致。因此，我们推测野生型中PtdIns4P含量在盐处理后的降低是由于OsPLC1的水解作用所致。由于PtdIns(4，5)P2在植物中含量很低，这种方法灵敏度有限，我们尚无法检测到PtdIns(4，5)P2的含量。 综上所述，本文采用了分子生物学、细胞生物学、生物化学等试验方法初步确定了OsPLC1的胞内定位，以及PtdIns(4，5)P2和PtdIns4P的亚细胞定位;通过对盐处理前后野生型和突变体中PtdIns4P含量的检测，初步证明OsPLC1在盐胁迫下在水稻体内能够水解PtdIns4P。