论文部分内容阅读
目的：建立具有人免疫学特性的NOD/SCID小鼠模型；制备膀胱肿瘤EJ细胞裂解物致敏的DC疫苗,将其应用于具有人免疫学特性的荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠进行膀胱癌的治疗,分析评价DC疫苗在模型小鼠体内抗膀胱癌的生物学效应,为DC疫苗治疗膀胱癌提供新的思路和理论基础。方法：第一部分：人免疫重建NOD/SCID小鼠模型的建立及其鉴定1.将经过渗漏筛查的16只正常NOD/SCID小鼠随机分为2组：实验组8只,每只腹腔注射人PBMC 4×107/0.5ml,作为人免疫重建组；对照组8只,每只腹腔注射0.5ml无菌PBS,作为空白对照组。2.从生物学特性和免疫学特性两个方面对小鼠模型进行鉴定：观察小鼠的生物学体征；第4周、8周、12周分别收集两组小鼠外周血、脾脏、肝脏：利用流式细胞术检测小鼠血中人CD3+T、CD19+B淋巴细胞；通过免疫组织化学染色的方法检测小鼠脾脏和肝脏组织中人CD3+T、CD19+B淋巴细胞的浸润情况；通过ELISA实验测定小鼠血中人IgG蛋白的含量。第二部分：EJ致敏的DC对人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠的抗肿瘤作用1.利用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a联合作用于经人外周血来源的单核细胞,体外培养诱导分化出DC细胞,通过细胞形态学以及细胞表面特异性标志来鉴定DC细胞；用冻融法获得的EJ肿瘤细胞裂解物致敏DC细胞,制备全肿瘤抗原致敏的DC疫苗；将DC疫苗腹腔注射于人免疫重建NOD/SCID小鼠,4周后取小鼠脾脏磁性细胞分选器(MACS)分选出人T淋巴细胞,[3H]-TdR掺入试验测定负载EJ抗原的DC对自体T细胞的增殖能力,51Cr释放试验检测两组DC(DC组和EJ-DC组)激活的T细胞细胞毒作用。2.将人膀胱癌EJ细胞接种于20只人免疫重建24h后的NOD/SCID小鼠,建立人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠模型；第10天后将其随机分为2组：DC-EJ疫苗组,10只,每只腹腔注射疫苗0.2ml(含EJ裂解物致敏的DC细胞数为2×105个)；DC组,10只,同法注射未致敏的DC细胞悬液0.2 ml(含未致敏DC细胞数为2×105个)。观察小鼠的生物学特性包括小鼠的生命体征及肿瘤组织的生长情况；治疗后利用ELISA检测小鼠血清中人IFN-γ浓度；免疫组织化学检测小鼠肝脏组织人T细胞、DC的浸润,流式细胞术检测脾脏、肿瘤组织人T细胞及DC的浸润；以及组织病理观察肿瘤组织病理情况。结果：第一部分：1. NOD/SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4周后流式细胞仪测得小鼠外周血中人CD3+T、CD19+B细胞百分率分别为85.6%、76.7%。2.免疫组织化学结果显示小鼠脾脏中存在人CD3+T、CD19+B细胞。3.移植人外周血单个核细胞4周、8周、12周后ELISA测得小鼠血清中人免疫球蛋白IgG的含量分别达到863μg/ml、1217μg/ml、958μg/ml。第二部分：1.负载与未负载EJ裂解物致敏的DC对自体T淋巴细胞的增殖刺激指数分别为7.2、1.0,负载与未负载EJ裂解物致敏的DC激发和扩增的CTL对EJ杀伤率分别为63.1±5.7%、21.5±4.8%,显著差异(P<0.05)。2.全部小鼠成瘤率均为100%,与DC组比较,DC-EJ组小鼠生存期显著延长、肿瘤体积增长幅度明显降低(P<0.01)。3.治疗后第1、2、3周DC-EJ组小鼠体内血清中人IFN-γ含量分别为19.6、26.8、23.7 IU/ml：而DC组在1、2、3周的含量分别仅为7.2、13.5、15.6 IU/ml,DC-EJ组均显著高于DC组(P<0.01)。流式细胞仪检测发现脾脏组织和肿瘤组织中人CD4+、CD8+T淋巴细胞、DC细胞的浸润EJ-DC组较DC组明显；但两组小鼠肝脏组织免疫组织化学染色未发现人CD4+、CD8+T淋巴细胞以及DC细胞的浸润；病理学证实小鼠肿瘤为膀胱癌。结论：1.经NOD/SCID小鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞,成功地人免疫重建NOD/SCID小鼠模型；重建后的模型为进一步实验打下了良好的基础。2.人外周血PBMC经粘附贴壁获得的DC前体细胞,进一步联合应用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a诱导,可获得大量典型的DC。3.负载肿瘤裂解物DC疫苗在体外能激活比较强的抗肿瘤免疫反应；作用在人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠体内可以明显减慢肿瘤生长速度、显著延长小鼠生存期。