脑卒中（Stroke）的发病率逐年升高,已成为全球性的疾病,每年全球约有4400万人因其导致残疾^[1],而其中约80%以上为缺血性脑卒中^[2]。目前,对缺血性脑卒中最有效的治疗方法是迅速恢复血液供应。因此,静脉溶栓和血管内介入治疗得到了广泛的应用和发展。但是,随着溶栓技术的开展,在给患者带来极大帮助的同时,脑缺血/再灌注损伤的发生率也越来越高,损伤后的神经功能障碍也愈发突出,改善脑缺血/再灌注损伤后的功能恢复已经成为一个亟待解决的关键问题。然而,脑缺血/再灌注损伤的机制比较复杂,对其机制的探讨也十分有限,并且还没有令人满意的治疗策略。因此,本研究将围绕脑缺血/再灌注损伤后神经功能的恢复进行探讨,力求能够找到可能有效的治疗。第一部分ALK5在脑缺血/再灌注损伤大鼠模型中的表达特点目的:主要探讨Activin receptor-like kinase 5（ALK5）在脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia/reperfusion,I/R）大鼠模型脑组织中的表达变化及定位。方法:1.采用线栓法构建Sprague-Dawley（SD）大鼠右侧大脑中动脉缺血/再灌注模型（middle cerebral occlusion/reperfusion,MCAO/R）。2.运用蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB）和免疫组化技术检测ALK5在建模后24 h和14 d的表达变化。3.运用免疫组织荧光双标技术检测I/R损伤皮层ALK5的细胞定位。结果:1.待SD大鼠再灌注复苏后,根据Longa-Z评分筛选得分≥1分且≤3分入组实验,TTC染色显示有明确梗死灶,建模成功。2.SD大鼠脑I/R损伤后24 h和14 d,损伤同侧皮层ALK5的表达较假手术组（Sham group）均明显升高（p<0.05）。3.在损伤同侧皮层,ALK5与beta-III tubulin（TUBB3）阳性细胞共定位,而与glial fibrillary acidic protein（GFAP）无共表达。结论:在脑I/R损伤SD大鼠的缺血同侧皮层中,ALK5的表达水平明显升高,且主要表达在神经元的细胞膜及细胞浆。在I/R组和Sham组中,ALK5表达的显著差异提示其在脑I/R损伤中可能发挥重要作用。第二部分ALK5对脑缺血/再灌注损伤后脑可塑性及运动功能恢复的作用目的:为了明确ALK5在脑I/R损伤后的作用,我们将评估ALK5对脑I/R损伤所致的运动神经功能障碍的影响。根据相关研究结果,我们推测ALK5对运动神经功能的影响可能与其调节脑可塑性有关。因此,在此部分研究中,我们将重点探讨ALK5对脑I/R损伤后脑可塑性的调节作用。方法:1.分别构建携带ALK5-RNAi和ALK5过表达片段的慢病毒（Lentivirus,LV）,然后将LV立体定位注射于SD大鼠缺血侧的感觉运动皮层以干预ALK5的表达。通过免疫组织荧光和WB来检测LV的干预效率。2.采用改良神经功能严重程度评分表（modified neurologicalseverity score,mNSS）和脱胶体感测试（adhesive-removal somatosensory test,ARST）来评估运动神经功能变化。3.通过免疫荧光双标分别检测ALK5与Nestin（神经干细胞标记物）、DCX（神经母细胞和未成熟神经元标记物）共定位关系,来反映脑I/R损伤后ALK5对神经再生的作用。4.检测病毒干预ALK5后轴突生长相关蛋白43（growth associated protein-43,GAP43）和神经丝蛋白200（neurofilament-200,NF-200）的表达变化,以反映脑I/R损伤后ALK5对轴突再生的调节作用。5.在脑I/R损伤对侧的感觉运动皮层立体定位注射生物素葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA）,神经示踪跨胼胝体中线的新生神经纤维以及皮质红核束（corticorubral tract,CRT）新生跨中线的神经轴突出芽,以反映脑I/R损伤后ALK5对轴突重组的调节作用。6.通过高尔基染色技术和Sholl分析法,检测病毒干预ALK5后,树突长度和分枝变化,以反映脑I/R损伤后ALK5对树突可塑性的调节作用。结果:1.免疫组织荧光显示,LV能够成功地转染至注射区域皮层细胞;WB检测结果显示,LV-ALK5-RNAi可以明显降低脑I/R损伤后ALK5的表达水平（p<0.05）,而LV-ALK5则可以明显升高脑I/R损伤后ALK5的表达水平（p<0.05）。2.mNSS和ARST两项评估均提示,再灌注后24 h、7 d和14 d,敲低ALK5不利于运动神经功能恢复,而过表达ALK5则可以促进神经功能恢复,这种趋势在7 d和14 d时更加显著（p<0.05）。3.免疫荧光双标结果显示,脑I/R损伤后,ALK5分别与Nestin、DCX有部分共定位表达。4.WB检测结果提示,敲低ALK5可明显抑制GAP43的表达（p<0.05）;相反,过表达ALK5则可以明显促进GAP43表达（p<0.05）。免疫组化显示,脑I/R损伤后,NF200阳性纤维明显变少、变短,且排列紊乱（p<0.05）;进一步敲低ALK5后,NF200阳性纤维则更少、更乱,多呈蘑菇头状,且14 d后恢复较差（p<0.05）;而过表达ALK5后,NF200阳性纤维损伤相对较小,14 d后恢复情况更好（p<0.05）。5.BDA神经示踪提示,敲低ALK5明显抑制跨胼胝体中线的新生神经纤维和CRT新生跨中线的轴突出芽（p<0.05）;过表达ALK5则可以显著促进跨中线的新生神经纤维和轴突出芽（p<0.05）。6.高尔基染色结果和Sholl分析显示,敲低ALK5不利于脑I/R损伤后树突的出芽和再生（p<0.05）,而过表达ALK5可以明显促进损伤后树突的恢复和再生（p<0.05）。结论:ALK5可能与脑I/R损伤后的神经再生有密切关系,它可以促进损伤后的轴突可塑性和树突可塑性。ALK5可能通过促进脑I/R损伤后的脑可塑性,从而在改善长期的运动神经功能恢复中发挥重要作用。第三部分ALK5通过激活Smad2/3和Gadd45b进而促进脑I/R损伤后的脑可塑性目的:ALK5/Smad2/Smad3作为一条经典信号通路,在体内发挥多种功能,既往有研究提示,ALK5可以通过激活Smad2/3促进生长抑制及DNA损伤诱导因子45b（growth arrest and DNA-damage inducible gene b,Gadd45b）的表达;而我们之前的研究表明,Gadd45b可以促进脑缺血后轴突可塑性和运动功能的恢复。基于此,我们推测ALK5可能亦通过激活Smad2/3来促进Gadd45b的表达,发挥调节脑I/R损伤后脑可塑性,从而改善运动神经功能的恢复。另外,我们既往研究发现,迷走神经电刺激（vagus nerve stimulation,VNS）可以促进脑缺血后运动神经功能的恢复;因此,我们推测VNS干预可能是通过调节ALK5/Smad2/Smad3/Gadd45b信号通路来发挥作用,以此探讨VNS应用于临床改善脑缺血后运动神经功能恢复的可能的分子机制。方法:1.LV-ALK5-RNAi立体定位注射至损伤同侧感觉运动皮层,抑制ALK5的表达,于建模后24 h和14 d通过WB检测病毒注射区脑组织中Smad2/3磷酸化水平和Gadd45b表达水平。2.LV-ALK5立体定位注射至损伤同侧运动感觉皮层,促进ALK5的表达,于建模后24 h和14 d通过WB检测病毒注射区脑组织中Smad2/3磷酸化水平和Gadd45b表达水平。3.采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测脑I/R损伤后ALK5与Gadd45b是否存在相互作用关系。4.建模成功后,给予VNS干预,30 min/d,持续14 d,操作过程中应监测SD大鼠的生理参数,并注意预防感染。结果:1.WB检测提示,LV-ALK5-RNAi在有效敲减ALK5表达的同时,明显抑制了Smad2/3磷酸化水平和Gadd45b的表达（p<0.05）。2.WB检测提示,LV-ALK5在明显促进ALK5表达的同时,也显著促进了Smad2/3磷酸化水平和Gadd45b的表达（p<0.05）。3.Co-IP结果显示,在脑I/R损伤后24 h和14 d,ALK5和Gadd45b均可能存在相互作用关系。4.WB结果提示,VNS干预可以促进ALK5的表达,并进一步促进Smad2/3磷酸化和Gadd45b表达水平（p<0.05）;VNS干预效果和LV-ALK5相当（p>0.05）。结论:ALK5表达水平和Smad2/3磷酸化水平、Gadd45b表达水平呈正相关;脑I/R损伤后,ALK5和Gadd45b可能存在相互作用。因此,我们认为,ALK5可能通过调控Smad2/3磷酸化水平促进Gadd45b的表达,进而调节脑I/R损伤后的脑可塑性。脑缺血后,VNS治疗可能通过调节ALK5/Smad2/Smad3/Gadd45b信号通路促进运动功能改善。