血吸虫病是一种流行广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。随着防治技术的进展，目前全球血吸虫病的防治策略已从灭螺和阻断传播为主转变为控制或减少发病为主，因此化疗成为控制干预措施的基石。尽管吡喹酮化疗是安全、有效的治疗手段，但不能预防再感染，人群治疗后迅速的再感染要求频繁的再治疗，必然导致化疗成本的增加，并可引起药物抗性的产生。人类和实验动物感染的研究证实，血吸虫感染后可产生部分的保护性免疫，即伴随免疫，这种免疫为疫苗的研制提供了理论依据。血吸虫在脊椎动物宿主体内并不繁殖，病变程度与虫荷有关，当虫荷降低50％或以上时就会明显减轻病理损害、降低患病率，并减少流行。因此，作为化疗合乎逻辑的补充，血吸虫疫苗的开发与应用不仅迫切需要，而且是一种更有效的控制措施。　　血吸虫疫苗的研制经历了死疫苗、减弱活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗的漫长过程，已筛选出了6种WHO认可的血吸虫疫苗候选抗原分子，即谷胱甘肽S转移酶(GST)、副肌球蛋白(Sm97)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、脂肪酸结合蛋白(Sm14)、23kDa膜蛋白(Sm23)、照射疫苗5(IrV-5)。但迄今为止，疫苗的研究工作尚无突破性进展，所获得的疫苗候选分子均难以稳定达到WHO要求的50％的免疫保护力。增强DNA疫苗的免疫效果是当前血吸虫疫苗研究的重点。　　树突状细胞(DC)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，在刺激免疫应答中起着核心作用。由于其独特的免疫刺激作用，因此DC被认为是肿瘤治疗和传染病预防疫苗设计的基础，尽管利用抗原致敏的自身DC来进行大规模的人类防治是不切实际的，但对DC特异性抗原靶向是发展有效疫苗的关键。　　本研究选用WHO认可的编码日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S转移酶(Sj26)基因作为候选分子，将此基因克隆入真核表达载体，构建重组质粒，转染至小鼠DC，获得稳定表达的细胞克隆。体外观察Sj26基因转染对DC功能的影响，并以BALB/c小鼠为动物模型观察Sj26基因转染的DC诱导的保护性免疫作用，初步探讨其免疫效应机制。以期通过DC作为载体诱导宿主产生高水平的Th1型抗日本血吸虫感染的保护性免疫作用，从而提高日本血吸虫DNA疫苗的免疫效果。　　本研究工作分为以下五个部分:　　一、DC和巨噬细胞对日本血吸虫抗原提呈作用的比较　　利用日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)分别致敏DC和巨噬细胞，将致敏、未致敏的DC、巨噬细胞分别免疫BALB/c小鼠3次，末次免疫后2周，每鼠经腹部皮肤感染40±2条日本血吸虫（大陆株）尾蚴，42天后门静脉灌注，计数成虫和肝脏中的虫卵，比较各组小鼠日本血吸虫虫荷和雌虫生殖能力（虫卵数/雌虫/小鼠肝脏），以评估DC和巨噬细胞对日本血吸虫抗原的提呈作用。　　与未致敏细胞免疫组小鼠比较，SEA致敏的DC和巨噬细胞免疫组小鼠的成虫数和虫卵数/雌虫明显减少（26.3％、37.9％和22.0％、30.7％），攻击感染后42天各组小鼠血清特异性抗体水平均升高，以致敏的DC免疫组小鼠最为明显。结果表明体外抗原致敏后，DC诱导的对日本血吸虫感染的保护性免疫力高于巨噬细胞，DC是日本血吸虫感染中主要的抗原提呈细胞。　　二、日本血吸虫重组质粒pcDNA3-Sj26的构建及其在DC中的表达　　PCR方法扩增Sj26基因片段，定向克隆至真核表达载体pcDNA3中，构建重组质粒pDNA3-Sj26，阳性克隆经双酶切、PCR扩增鉴定，用双脱氧链末端终止法进行序列测定。结果:PCR扩增得到特异的Sj26基因片段，双酶切及PCR扩增鉴定表明获得正确的pcDNA3-Sj26重组质粒;测序结果显示，核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank报道的Sj26的序列的一致性均为99％，片段插入正确。结果表明pcDNA3-Sj26真核表达重组质粒构建成功。　　采用脂质体介导的基因转染方法将pcDNA3-Sj26和质粒pcDNA3稳定转染至小鼠DC，G418加压筛选获得阳性克隆并传代培养。RT-PCR检测Sj26mRNA的转录水平，SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光试验检测DC中Sj26蛋白的表达。RT-PCR结果显示Sj26基因转染的DC中有Sj26mRNA的表达，SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光试验显示Sj26基因转染的DC中有Sj26蛋白的表达。结果表明构建的真核表达重组质粒pcDNA3-Sj26成功地转染至小鼠DC并在DC中获得表达，表达的Sj26蛋白能被感染小鼠血清所识别。　　三、Sj26基因转染对DC功能的影响　　利用脂质体介导的基因转染方法将Sj26基因转染至小鼠DC后，流式细胞术(FACS)检测Sj26基因转染的DC摄取抗原的能力，混合淋巴细胞反应(MLR)检测Sj26基因转染的DC对同种异体T淋巴细胞的刺激作用。　　Sj26基因转染后Sj26蛋白在DC中高表达，Sj26基因转染的DC摄取抗原的能力降低，与质粒pcDNA3转染的DC和未转染的DC相比较，Sj26基因转染的DC能明显刺激混合淋巴细胞反应。结果表明Sj26基因转染DC后能促进DC的活化，增强DC的生物学活性。　　四、Sj26基因转染的DC对日本血吸虫感染的保护性免疫作用　　利用Sj26基因转染的DC、质粒pcDNA3转染的DC和未处理的DC分别经耳廓注射BALB/c小鼠3次，同时设pcDNA3-Sj26、Sj26蛋白和RPMI-1640对照组，末次免疫后2周，每鼠经腹部皮肤感染40±2条日本血吸虫（大陆株）尾蚴。攻击感染后6周剖杀小鼠，计数成虫和虫卵，以减虫率和减卵率来评价其保护性免疫作用。　　结果Sj26基因转染的DC免疫小鼠获34.5％的减虫率和48.5％的减卵率，明显高于质粒pcDNA3转染的DC组（16.8％和15.8％）和未处理的DC组（14.6％和14.4％），质粒pcDNA3转染的DC和未处理的DC组之间无显著性差异。Sj26基因转染的DC免疫小鼠后，诱导的保护性免疫力高于pcDNA3-Sj26和Sj26蛋白免疫组小鼠。结果表明Sj26基因转染的DC可诱导对日本血吸虫感染的保护性免疫作用，DC作为载体能有效增强Sj26DNA疫苗的免疫效果。　　五、Sj26基因转染的DC抗日本血吸虫感染的免疫效应机制　　实验动物分组、免疫接种和攻击感染方案同第四部分。分别于免疫前、末次免疫后2周、攻击感染后6周收集小鼠血清，ELISA分别检测小鼠血清中总IgG水平，Western blot检测抗Sj26特异性抗体。ELISA检测免疫前、末次免疫后2周小鼠血清IFN-γ和IL-4的水平。攻击感染后6周脾淋巴细胞培养法检测经ConA和SEA刺激后，小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平。并以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖。　　结果:末次免疫后2周，Sj26基因转染的DC免疫组小鼠血清IgG抗体水平显著升高，Western blot结果显示免疫小鼠产生了抗Sj26特异性IgG抗体。各组小鼠免疫前、后血清IL-4的水平无明显变化，Sj26基因转染的DC免疫组小鼠血清IFN-γ的含量明显增高(P＜0.05），亦高于质粒pcDNA3转染的DC免疫组和未处理的DC免疫组(P＜0.05);与免疫前相比较，质粒pcDNA3转染的DC免疫组和未处理的DC免疫组小鼠血清IFN-γ的含量亦升高。经ConA和SEA刺激，Sj26基因转染的DC免疫组小鼠脾淋巴细胞产生高水平的IFN-γ(P＜0.01)，而IL-4的产生低于其它组。Sj26基因转染的DC免疫组小鼠的脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后的刺激指数高于其它组，而质粒pcDNA3转染的DC和未处理的DC免疫组与RPMI-1640对照组之间无明显差异。结果表明体液免疫和细胞免疫共同参与了Sj26基因转染的DC诱导的保护性免疫作用，Sj26基因转染的DC免疫小鼠主要诱导Th1型免疫应答，在日本血吸虫感染的保护性免疫中起主要作用。　　本研究工作获得了如下主要结果:1.本文首次证实，DC诱导的对日本血吸虫感染的保护性免疫作用强于巨噬细胞，是血吸虫感染中的主要抗原提呈细胞。2.成功地构建pcDNA3-Sj26真核表达重组质粒。3.构建的真核表达重组质粒pcDNA3-Sj26首次成功地转染至小鼠DC并在DC中获得表达，表达的Sj26蛋白能被感染小鼠血清所识别。4.体外研究证实，Sj26基因转染DC后能促进DC的活化，增强DC的生物学活性。5.Sj26基因转染的DC可诱导小鼠产生对日本血吸虫感染的保护性免疫作用，减虫率为34.5％，减卵率为48.5％，明显高于质粒pcDNA3转染的DC组（16.8％和15.8％）和未处理的DC组（14.6％和14.4％）。6.Sj26基因转染的DC免疫小鼠，诱导的保护性免疫作用高于pcDNA3-Sj26和Sj26蛋白免疫组小鼠，首次证实DC作为载体能有效增强Sj26DNA疫苗的免疫效果。7.体液免疫和细胞免疫共同参与了Sj26基因转染的DC诱导的保护性免疫作用，其中Th1型免疫应答在日本血吸虫感染的保护性免疫中起主要作用。