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反相蛋白质阵列(Reverse-Phase Protein Array,RPPA)技术已经成为强大、灵敏、成本有效、高通量的平台技术方法,用于大量样品的组织或细胞蛋白质分析。通过与磷酸化抗体相结合手段,RPPA能同时测定总蛋白与磷酸化后修饰蛋白,代表了捕获正常或患病细胞中信号通路及关键信号的绝佳方法。RPPA非常适用于生物标志物的发现、临床试验中活检样本的分析、药效学评估、受肿瘤靶向治疗影响的关键蛋白分析等领域,并正逐步发展为肿瘤分型、患者预后、合理药物指导、个性化治疗等临床应用的有力工具。目的:通过制备、鉴定与筛选可靠应用于反相蛋白阵列的磷酸化抗体探针,建立细胞信号通路模型,以筛选的磷酸化抗体探针,利用RPPA技术探测细胞通路模型的信号,以便将该技术进一步应用于新药开发、临床样本分析等领域。方法:制备Akt、MAPK、酪氨酸激酶(RTK)通路中关键激酶的磷酸化抗体,先通过常规免疫学方法对制备抗体进行应用验证;将应用验证后抗体进一步应用于RPPA筛选,筛选出RPPA适用性与可靠性磷酸化抗体作为RPPA探针;使用LNCa P细胞,在4种方式(EGF,LY294,PMA,Na Cl)刺激下建立Akt、Erk/MAPK细胞信号通路模型;利用抗体探针与RPPA技术进行细胞信号通路模型分析。结果:该项目获得53个通过免疫印迹(WB)、免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)应用方法验证的磷酸化抗体;通过RPPA筛选获得25个RPPA高适用性与可靠性抗体探针;将10个RPPA筛选的高质量抗体探针应用于Akt、MAPK信号通路模型分析,获得4组LNCa P刺激模型的RPPA测试数据。4组模型结果均显示了通路中关键信号分子响应于4个外部扰动的磷酸化状态的动态变化。RPPA结果数据与相应的免疫印迹法(WB)分析结果一致,证实了分析数据的有效性与可靠性。结论:成功筛选出RPPA高适用性与可靠性磷酸化抗体探针,成功将抗体探针与RPPA结合应用于细胞信号通路模型分析。表明所制备的抗体探针与RPPA技术平台相结合,极适合于分析细胞信号通路模型。该方法能够有效地拓展RPPA探针,使其成为新药开发、临床样本分析等领域的先进工具。