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目的研究表皮细胞与自体微粒皮联合修复深度创面的效果,为救治大面积深度烧伤患者,促进创面的修复提供实验基础。方法1.表皮细胞的分离培养与功能表皮细胞的构建取新鲜人体包皮组织,通过两步酶消化法分离得到表皮细胞,传代培养。(1)最佳病毒感染复数的测定：将携带EGF基因和GFP基因的腺病毒(Ad-hEGF)以不同感染复数(MOl值分别为0,5,20,50,100,150,200)转染表皮细胞。转染后24、48、72 h,倒置相差显微镜下观察细胞的形态,倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光表达,流式细胞仪检测转染率,ELISA法检测收集的细胞上清液中EGF浓度,CCK-8法检测细胞的增殖率,确定最佳的病毒感染复数。(2)转染后细胞分泌EGF生物活性的检测：将细胞分为未转染组(对照组)和转染组。对照组用未转染的表皮细胞培养上清液孵育,转染组用最佳Mol值(50)Ad-hEGF转染后的表皮细胞培养上清液孵育,分别于孵育后1、3、5d, CCK-8法检测两组细胞的增殖率。(3)转染后细胞分化相关标志物表达的检测：将细胞分为未转染组(对照组)和转染组。对照组不加Ad-hEGF,转染组用最佳MOI值(50)Ad-hEGF转染表皮细胞。培养24 h后,免疫荧光染色法检测表皮细胞分化相关标志物CK14、CK19表达。(4)转染后细胞迁移能力的检测：将细胞分为未转染组(对照组)和转染组。对照组不加Ad-hEGF,转染组用最佳MOI值(50)Ad-hEGF转染表皮细胞。于划痕后0、12、24、48 h，倒置相差显徼镜下观察细胞迁移情况。2.细胞-微粒皮法修复大鼠全层皮肤缺损创面的实验研究取健康清洁级成年SD大鼠70只,体质量210-230 g,采用随机数字表法分为7组,每组10只,Ⅰ组：微粒皮(1:10)移植组,Ⅱ组：微粒皮(1：20)移植组,Ⅲ组：微粒皮(1：20)+普通表皮细胞移植组,Ⅳ组：微粒皮(1:20)+EGF高表达的表皮细胞移植组,Ⅴ组：普通表皮细胞移植组,Ⅵ组：EGF高表达的表皮细胞移植组，Ⅶ组：对照组。35只Wistar大鼠用于制备异体中厚皮,同时将70只SD大鼠背部制作大鼠全层皮肤缺损创面抗挛缩模型。将各组移植物分别移植到相应创面,各组均覆盖由成年Wistar大鼠背部皮肤制备的同种异体中厚皮。(1)创面大体观察及愈合率的测定：术后观察大鼠存活情况：术后7d、14 d、21d观察各组大鼠背部同种异体皮成活、脱落及创面愈合情况,同种异体皮脱落后计算创面愈合率。(2)创面组织学的检测：术后21 d时取材行组织学及免疫组织化学染色,观察创面修复情况。(3)创面组织中EGF mRNA水平的检测：术后7d、14 d、21 d创面取材行Real-time PCR分析创面组织中EGF mRNA水平。结果1.表皮细胞的分离培养与功能表皮细胞的构建(1)最佳病毒感染复数的测定：转染后24、48 h,各组表皮细胞形态比较无明显改变,均呈小的多角形,胞体透亮，细胞核居中较大。转染后72h, MOI=200转染组的细胞碎片较其他组明显增多。对照组表皮细胞未见绿色荧光蛋白表达,而各转染组表皮细胞可见绿色荧光蛋白表达。转染后72h,MOI=50,100,150,200转染组表皮细胞转染率均大于90%,对照组及MOI=5,20转染组表皮细胞的转染率分别为(0.51±0.20)%、(62.44±6.23)%、(75.00±5.43)%，明显低于MOI=50转染组的(93.12±2.55)%(P值均小于0.01)。随着转染时间的延长,各转染组表皮细胞上清液中EGF浓度逐渐增高。转染后72 h,MOI=50转染组表皮细胞上清液中EGF浓度明显高于其余各组(P值均小于0.01)。转染后24、48 h，各组表皮细胞增殖率相近(P值均大于0.05)。转染后72 h,MOI=200转染组表皮细胞增殖率明显低于其余各组(P值均小于0.05)。(2)转染后细胞分泌EGF生物活性的检测：孵育后1d,转染组与对照组表皮细胞的增殖率相近(P>0.05)。孵育后3、5 d，转染组表皮细胞增殖率分别为1.10±0.11、1.87±0.21,明显高于对照组的0.69±0.09、0.82±0.08(P值均小于0.01)。(3)转染后细胞分化相关标志物表达的检测：转染后24 h，转染组表皮细胞分化相关标志物CK14、CK19表达较对照组增强。(4)转染后细胞迁移能力的检测：划痕后48 h，转染组细胞已基本爬满划痕,对照组细胞仍未爬行至划痕中心。划痕后12～48 h,2组细胞迁移距离比较,差异有统计学意义(P值均小于0.01)。2.细胞-微粒皮法修复大鼠全层皮肤缺损创面的实验研究(1)创面大体观察及愈合率的测定：术后大鼠均存活至实验完成。术后各组大鼠同种异体皮随时间延长逐渐成活,干燥并开始脱痴,至同种异体皮基本脱落后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组创面可见成片上皮,Ⅴ组创面可见菲薄上皮,Ⅵ组残留大部分创面,Ⅶ组创面无上皮形成。同种异体皮脱落后(术后21 d时)，、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组创面愈合率分别为83.2%±5.6%、66.0%±6.0%、73.6%±5.3%、83.7%±4.3%、36.5%±6.1%、66.5%±5.1%、22.7%±5.5%，Ⅰ、Ⅳ组创面愈合率显著高于其余各组(P<0.01)，Ⅲ组创面愈合率高于Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组(P<0.05)，Ⅱ、Ⅵ组创面愈合率高于Ⅴ、Ⅶ组(P<0.01),Ⅴ组创面愈合率高于Ⅶ组,比较差异有统计学意义(P<0.01);Ⅰ、Ⅳ组间创面愈合率比较差异无统计学意义(P>0.05),Ⅱ、Ⅵ组间创面愈合率比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)创面组织学的检测：组织学观察,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组创面上皮分层明显,表皮层较厚,基底层呈柱状排列,Ⅴ、Ⅵ组创面可见表皮层含有较多空泡,且细胞排列疏松,Ⅶ组为肉茅组织。免疫组织化学染色观察,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组表皮-真皮连接层的Ⅳ型胶原表达呈阳性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组表皮-真皮连接层的层黏连蛋白表达呈阳性,Ⅶ组均呈阴性。(3)创面组织中EGF mRNA水平的检测：术后7d和14d，Ⅳ和Ⅵ组的EGF mRNA表达水平显著高于其他组(P<0.01)。术后21 d, EGF mRNA的表达在所有组几乎检测不到。结论1. Ad-hEGF转染表皮细胞的合适MOI值为50-150,以50为最佳,既能高效表达目的基因,又可保持良好的细胞生物学特性。2.普通表皮细胞与自体微粒皮联合移植可提高创面愈合率,提升自体皮修复大创面的效率,减少自体皮的使用,为利用少量残存皮肤修复深度烧伤创面提供了很好的方法。3.EGF高表达的表皮细胞与自体微粒皮联合移植通过细胞分泌的EGF.可加速创面愈合,提高创面愈合率,其修复深度烧伤创面效果更好，可显著提高残存自体皮的利用率。但是,目前基因转染方法限制了临床应用,基因表达上调的方法尚需进一步探索。