研究背景睡眠占据人类生命三分之一的时间,充足的睡眠可以帮助消除疲劳,增强人体免疫力,是人类健康不可或缺的过程。长期睡眠不足的人更容易出现健康问题,即使睡眠只减少几个小时,也可能导致免疫系统功能减退,五天不睡就会危及人的生命安全。然而,在人口老年化的社会,人类面临的压力空前膨胀,睡眠障碍已经成为影响人们健康的一种极为普遍的问题,其高发病率已经对人类社会生活造成极大的威胁。其中失眠是各种睡眠障碍最常见的症状。国内流行病学调查表明：失眠总发病率在26.27%,女性发病率明显高于男性。失眠与年龄有关,年龄越大,失眠发病率越高。事实上,慢性疾病也是失眠的非常重要的危险因子,据估计,接近75%-90%的失眠患者有伴随疾病状态的并发性失眠。许多慢性疾病都会出现睡眠障碍或以睡眠障碍为主要表现,如慢性皮肤病,类风湿关节炎等,神经系统疾病如脑血管病、周围神经疾病、变性疾病等以失眠为主诉的也越来越常见,尤其是老年患者。慢性脑缺血是脑灌流动脉狭窄或闭塞所引起的一种很常见的缺血性脑血管疾病。临床主要表现有头晕、头痛、失眠、肢体麻木、记忆力减退、情绪低落等,无神经系统局灶性定位体征,但反复发作。据统计中老年人群中有2/3的人患有慢性脑供血不足,属中老年人的多发病。临床发现椎基动脉供血不足的病人许多都是以睡眠障碍为主诉来就诊的,特别是年龄超过45岁的患者,其失眠大多与脑动脉硬化及颈椎病引起的慢性脑供血不足有密切关系。慢性脑缺血病因复杂,发病机制尚未完全明了,现代医学缺乏有明确疗效的药物,更没有专门应用于防治其伴发睡眠障碍的药物。只是笼统的利用镇静催眠、抗抑郁、抗组胺等疗法解决患者失眠问题,这类药物往往副作用大、容易成瘾。祖国医学认为“眩晕”、“头痛”、“失眠”、“健忘”等病均归属“慢性脑供血不足”。历代医家有“无虚不作眩”、“无瘀不作眩”之说。其病位在脑,以虚为本,由于病程迁延,往往多因兼见,虚实并存。本课题组长期的临床实践也表明改善慢性脑供血不足可有效治疗睡眠障碍。乌龙丹系国家级名老中医臧堃堂教授临床经验方,在南方医院作为医院制剂已使用多年,在临床上常用于治疗脑梗塞、脑栓塞、短暂性脑缺血发作、中风后遗症及恢复期、脑动脉硬化、脑萎缩及高血压头晕头痛、颈椎病(椎-基底动脉供血不足型)、颅脑外伤或手术后遗症等缺血性脑病,效果显著,其改善睡眠障碍的效果也非常显著。是中药复方多成分,多靶点疗法给这类患者带来了福音。但是,目前尚未有关于慢性脑缺血并发失眠的机制研究探讨,也未见有中药治疗的机理研究。目的和意义睡眠剥夺(sleep deprivation SD)是采用人工技术减少正常睡眠量,造成睡眠障碍,大多数研究者以此作为对睡眠功能及睡眠障碍机制研究的窗口。本研究通过复制慢性脑缺血合并睡眠剥夺模型,观察慢性脑缺血后睡眠剥夺大鼠相关指标的改变,探讨慢性脑缺血伴发失眠的可能的机制,从而为本课题组进一步揭示乌龙丹疗效的机理提供前期基础,也为更好的应用于临床提供实验依据。方法1、动物模型制作及分组购入动物后适应性喂养1周后,采用国内的改进的双侧颈总动脉永久结扎法复制慢性脑缺血模型。假手术组只分离双侧颈总动脉,不结扎,其余处理同手术组。空白组不做任何处理。大鼠造模后3周,存活66只大鼠随机分为：空白组、假手术组、模型组、空白+SD12h组、假手术+SD12h组、模型+SD12h组、空白+SD3d组、假手术+SD3d组、模型+SD3d组共9组。大鼠造模3周后,SD组大鼠每天小平台适应1小时,1周后行睡眠剥夺。2、睡眠剥夺大鼠模型的建立与复制利用本课题组的实用新型专利技术“大鼠睡眠剥夺自动记录仪”(专利号：ZL 2009 20059193.3)制备睡眠剥夺大鼠模型。睡眠剥夺采用小平台水环境法(flower pots technique)复制该模型。具体操作为：制作40×40×50cm的鼠箱,中间有直径4.5cm,高10.0cm的平台,平台周边注满水,高约8.0cm,睡眠剥夺自动记录仪探头由箱底穿入平台柱中,距离平台顶端2.0cm左右(注：此睡眠剥夺自动记录仪能够记录大鼠睡眠剥夺期间的落水次数,是其他睡眠剥夺实验所不能比拟的)。3、慢性脑缺血对睡眠剥夺大鼠行为学影响的实验大鼠落水次数及每次落入水中的时间由睡眠剥夺自动记录仪自动记录。4、慢性脑缺血大鼠及其REM睡眠剥夺后下丘脑食欲素原mRNA的表达变化的实验10%水合氯醛3.5ml/100g腹腔注射大鼠麻醉后快速断头取脑,置于-4℃冰箱5分钟,冻至质稍硬后,剥离下丘脑组织,置入冻存管中,液氮速冻后置于-80℃保存待用。提取总RNA,行荧光定量PCR实验。5、慢性脑缺血大鼠及其REM睡眠剥夺后下丘脑食欲素免疫阳性神经元表达变化的实验10%水合氯醛4.0ml/100g腹腔注射大鼠深麻醉后,沿腹中线剪开胸骨,暴露心脏,用16号针头穿刺通过左心室至升主动脉,用大弯钳夹住针头固定,再用剪刀剪破右心耳,先用PBS溶液快速冲洗,直至流出的液体为无色澄清液,再灌注含4%多聚甲醛的O.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)。剥离下丘脑组织,在10%中性甲醛固定液中固定。按操作规程进行脱水,透明处理,石蜡包埋,切片,行免疫组化染色。6、统计学分析使用SPSS13.0 for windows统计软件进行分析。实验数据均采用均数±标准差(X+s)表示,统计方法使用重复测量方差分析,单因素方差分析(One-way ANOVA)及两样本T检验,组间多重比较方差齐时使用LSD方法,不齐时使用Dunntt’sT3。选取检验水准a=0.05。结果1、慢性脑缺血对睡眠剥夺大鼠行为学影响的实验采用重复测量和单因素方差分析结果表明：时间点和组别之间有交互效应(F=13.769,P=0.000)；组别之间有主效应(F=22.952,P=0.000)；各时间点之间有主效应(F=228.232,P=0.000),需进行两两比较。SD3d组大鼠各组间的落水次数第1天差异不具统计学意义,模型组+SD3d组第2天、第3天及落水总次数均比空白组及假手术组少(P<0.01)。2、慢性脑缺血大鼠及其REM睡眠剥夺后下丘脑食欲素原mRNA的表达变化的实验各组大鼠下丘脑食欲素mRNA数据经One-way ANOVA分析组间有显著性差异(F=81.127,P=0.000),需进行两两比较(采用Dunnett’s T3)。与假手术组相比,模型+SD12h组、SD3d各组下丘脑的食欲素原mRNA表达均上升(P<0.01)；与空白组相比,模型组大鼠表达下降,95%可信区间为(0.10,1.29),模型+SD12h组、空白+SD3d组及模型+SD3d组表达均上升,95%可信区间为分别为(-6.46,-1.05)(-12.63,-0.77)(-8.93,-0.07)。模型+SD12h与假手术+SD12h组相比下丘脑食欲素原mRNA表达增加(P<0.01),SD3d各组间虽无统计学意义,但有模型+SD3d组有上升的趋势。3、慢性脑缺血大鼠及其REM睡眠剥夺后下丘脑食欲素免疫阳性神经元表达变化的实验数据经One-way ANOVA分析组间有显著性差异(F=110.765,P=0.000),需进行两两比较(采用LSD法)。与空白组相比模型+SD12h组、空白+SD3d组、假手术+SD3d及模型+SD3d组食欲素神经元个数与平均面积均增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1、慢性脑缺血与正常大鼠相比在应付短暂刺激的能力相当,但是对持久的应激更加敏感,使大鼠保持高度的觉醒状态,立于小平台上的持久力增强,SD期间落水次数减少。2、慢性脑缺血组较空白组下丘脑食欲素mRNA表达有所下降,这可能是机体的保护性反应,与假手术相比,模型+SD12h组、SD3d各组下丘脑的食欲素原mRNA表达均上升(P<0.01),与以往睡眠剥夺可以增加食欲素原mRNA的研究是相一致的。与空白组比较,模型+SD12h组、空白+SD3d组、模型+SD3d组食欲素原mRNA表达量均有所增加,但是施与睡眠剥夺12h及3d后,模型组与空白组比较,食欲素原mRNA反而升高,说明平衡了睡眠剥夺因素外,慢性脑缺血是造成食欲素原mRNA表达上升的原因。3、短时间的睡眠剥夺应激过程不能激活下丘脑食欲素神经元,免疫阳性细胞总数及平均面积未见增加。SD3d可以增加下丘脑食欲素免疫阳性细胞的表达。但是模型组大鼠更易受睡眠剥夺刺激的影响,与空白组相比,模型+SD12h组食欲素神经元个数及平均面积增加,与空白+SD3d组相比,模型+SD3d组食欲素神经元个数及平均面积亦有所增加,差别具有统计学意义(P<0.01)。即在应激下,模型组大鼠比空白组更易激活食欲素神经元,使其数量及平均面积增加。