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CRISPR/Cas9系统作为一种有效的基因编辑工具,已广泛应用于转基因动物制备和功能性基因解析等研究领域。研究证实,ROSA26基因在几乎所有生物体中都能编码一种非必需RNA,现已成为外源基因插入的重要位点。为了建立利用CRISPR/Cas9系统的定点整合外源基因于打靶ROSA26位点的同源重组方法,本研究通过设计绵羊ROSA26位点的sgRNA及ROSA26左、右同源臂表达载体,利用CRISPR/Cas9方法将荧光报告基因GFP定点插入绵羊脐带间充质干细胞的ROSA26位点,并通过分子生物学方法检测其外源基因GFP的同源重组情况。通过研究获得结果如下。1.绵羊ROSA26 sgRNA/Cas9同源打靶载体的构建。根据王楚端等人发表的绵羊ROSA26的基因序列,在张锋建立的http://crispr.mit.edu/网站上检索可用sgRNA序列,根据评分和位置选择1781-1800bp处的一段碱基序列为本研究所用sgRNA靶序列,并通过点突变法与PX330载体引入部位序列结合。经序列分析正确后,成功构建绵羊ROSA26 sgRNA/Cas9打靶载体sROSA26-sgRNA-1。2.绵羊ROSA26 sgRNA/Cas9同源打靶载体的活性验证。将获得的sROSA26-sgRNA-1转染到绵羊脐带间充质干细胞中,利用T7E1酶酶切反应检测sgRNA/Cas9酶切效率。根据公式:突变率=突变型带/(野生型带+突变型带),对琼脂糖凝胶电泳结果进行灰度分析,效率约为20%,表明成功构建具有切割打靶活性的ROSA26sgRNA/Cas9同源打靶载体。3.绵羊ROSA26左右同源臂表达载体构建。根据上述设计的sgRNA序列在绵羊ROSA26基因打靶位点的上下游设计左、右同源臂前后引物,长度分别为1093bp和928bp,并与表达载体DC-DON-SH02 ROSA26相连。经过PCR、酶切和测序鉴定正确后,成功获得绵羊ROSA26左右同源臂表达载体sROSA26-HA。4.阳性细胞克隆筛选和同源重组检测。利用Lipofectamine2000共转染sROSA26-sgRNA-1和sROSA26-HA到绵羊脐带间充质干细胞中,经过最佳筛选浓度1.5mg/mL Puro筛选14天后,更换新鲜培养基,2天后,得到表达绿色荧光蛋白的阳性克隆。PCR检测同源重组插入片段,分别得到预期1446bp和1020bp大小的片段,表明成功利用CRISPR/Cas9系统对绵羊脐带间充质干细胞ROSA26位点进行基因编辑,敲入了报告基因GFP。上述结果表明,本研究成功利用CRISPR/Cas9系统打靶绵羊ROSA26位点,并通过同源重组插入报告基因GFP,建立了CRISPR/Cas9介导的绵羊脐带间充质干细胞外源GFP基因敲入方法。本研究结果为进一步深入研究利用绵羊脐带间充质干细胞的绵羊功能基因解析和转基因绵羊的制备提供了科学依据。