目的:乳腺癌是影响妇女健康最常见的恶性肿瘤之一,据预测其发病率和死亡率将在几年内显著增加,其中年龄小于45岁的女性人群中乳腺癌发病率增加明显,表明乳腺癌已是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管乳腺癌的早期诊断和治疗已取得实质性进展,但其难治性和复发率的上升仍值得关注。因此,我们有必要提高对乳腺癌的进一步认识。探寻乳腺癌发病与进展的机制有助于乳腺癌的筛查诊断和靶向治疗,同时也可以为乳腺癌的预后判断提供新的思路和依据。丝裂原细胞外信号调节激酶(mitogen extracellular signal—regulated kinase,MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号转导途径是进化保守的信号转导途径,在肿瘤发生中至关重要的。该通路通常在多种恶性肿瘤中异常激活,通过三级激酶级联的形式在肿瘤侵袭和转移的过程中将信号放大。MEK/ERK信号通路的异常激活导致肿瘤细胞分化和凋亡丧失,同时增加了其增殖和侵袭的能力,从而引起肿瘤的发生和后期的转移。Ras在细胞膜上激活了MEK/ERK途径,后者激活了Raf,启动了磷酸化级联反应,从而导致了MEK1/2和ERK1/2的顺序激活。乳腺癌组织中ERK的表达明显高于良性增生性乳腺组织,并且与良性增生性乳腺组织相比,在严重的非典型增生和乳腺癌组织中ERK的磷酸化水平增加,这表明异常增加的ERK激活在非典型增生发展为癌症中起着重要作用,并且可以促进乳腺癌细胞的增殖。磷酸化的ERK(p-ERK)进入细胞核后会磷酸化某些特定的转录因子,例如c-Myc和c-Jun。p-ERK减少会降低基质金属蛋白酶MMP1和MMP9的表达,从而显著抑制乳腺癌的侵袭性。在乳腺癌细胞中,ERK失活伴随着细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和BCL2失活,从而导致细胞凋亡。FAM基因(family with sequence similarity,家族序列相似性基因)是近年来新发现的一类基因,它们的蛋白质序列具有相似性。这类基因已被证实与多种肿瘤的发生有关,包括乳腺癌,非小细胞肺癌,肺腺癌,肾细胞癌,前列腺癌,结肠直肠癌和食道鳞状细胞癌,它们在增殖,凋亡,迁移和侵袭方面起着重要的作用。FAM53家族是脊椎动物特有的蛋白质家族,可与调节细胞增殖的转录调节因子结合,影响神经管发育。该家族由三个同源基因编码:FAM53A,FAM53B和FAM53C。FAM53A,也称为背神经管核蛋白,通过指定神经管内背细胞的命运,被认为在神经发育中起重要作用。在基于TP53的相互作用分析中鉴定出FAM53A的表达定量性状基因座变异体与乳腺癌治疗药物阿霉素的使用相关联。在三阴性,TP53错义突变型的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,FAM53A的下调增加了乳腺癌细胞对阿霉素的抗性。然而,在luminal B、TP53截短突变型的乳腺癌细胞系MDA-MB-361和luminal A、TP53野生型的乳腺癌细胞系MCF7中,FAM53A的下调反而导致乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性增加。然而,FAM53A在乳腺癌中的作用尚不清楚,并且其与乳腺癌的临床病理学相关性也尚未报道。在这项研究中,我们检测了FAM53A在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达和定位。然后,我们上调或下调两种乳腺癌细胞系中FAM53A的表达,以探究其对乳腺癌细胞的生物学行为的影响,以及FAM53A如何影响乳腺癌的具体的分子生物学机制。研究方法:1.免疫荧光将乳腺癌细胞接种细胞于24孔板中的玻片上,用4%多聚甲醛固定15分钟,在5%BSA中封闭2小时,然后与抗FAM53A抗体(1:100)在4℃孵育过夜。第二天,将细胞与荧光二抗在室温避光条件下孵育2小时,DAPI染核。使用荧光显微镜激发目标光,进行观察并拍照。2.免疫组织化学染色实验我们选取了199位患者的原发性肿瘤标本进行临床病理相关性分析。上述全部患者标本均取自女性乳腺癌患者,年龄在36至87岁之间,均被诊断为浸润性导管癌,在2011年至2013年之间于中国医科大学附属第一医院完成手术切除。这199位参与此次病理相关性分析的乳腺癌患者手术前均未行任何放化疗或内分泌等辅助治疗。关于肿瘤大小分类,我们选取五厘米为分界线。肿瘤直径小于等于五厘米的病例有92例,大于五厘米的病例有107例。依据2009年AJCC乳腺癌分期标准进行TNM分期,以及患者病理档案资料显示,Ⅰ期和Ⅱ期患者共计109例,Ⅲ期患者共计90例。未发生淋巴结远处转移的病例有119例,发生淋巴结远处转移的病例有80例。所有病例中p53染色阴性的有115例,p53染色阳性的病例有84例。ER、PR、HER-2三阴的乳腺癌病例有23例,而非三阴性乳腺癌的病例有176例。将手术切除的肿瘤标本固定在10%中性福尔马林里,包埋在石蜡中,并连续切成4μm厚的切片。通过免疫组织化学染色,进行FAM53A的染色。使用免疫反应评分(IRS)半定量评价FAM53A染色的强度,其计算如下:IRS=PP×SI。PP:0=无染色;1=1-25%;2=26-50%;3=51-75%;和4=76-100%。SI:0=无染色;1=弱;2=中等;3=强染色。将每个肿瘤样本的得分相乘,得到0到9的最终得分。评分>3的肿瘤样本被认为显示出高FAM53A表达,而评分≤3的肿瘤样本被认为显示低FAM53A表达。通过使用SPSS 16.0软件进行分析,选取单样本配对t检验方法,分析FAM53A的表达水平与各个临床病理相关因素之间的统计学关系。P值小于0.05界定为具有统计学意义。3.细胞培养MCF-10A,MCF-7,T47D,MDA-MB-231,BT-474和BT-549细胞株获自中科院上海细胞库(中国上海),并通过短串联重复(STR)DNA分析进行鉴定。收到后,将细胞培养传代并冻存细胞株。将MCF-10A细胞在补充有5%马血清,10μg/ml胰岛素和20 ng/ml EGF的DMEM/F12(1:1)中培养。MDA-MB-231细胞在补充有10%FBS的L15中培养。MCF7,T47D细胞常规培养在补充有10%FBS的DMEM中。BT-474和BT-549细胞株在补充有10%FBS的RPMI-1640中培养。所有细胞均在无菌培养瓶中培养,用0.25%胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化,每两天进行传代培养。上述细胞株均保持在37℃的5%CO2培养箱中培养。4.质粒转染和si RNA干扰质粒p CMV6-ddk-myc和p CMV6-ddk-myc-FAM53A使用Xfect转染试剂,严格根据制造商的说明书进行细胞转染。转染前一天,细胞接种于2 m L完全生长培养基中,当细胞浓度为50–70%融合时进行转染。FAM53A(sc-88998)和非靶向对照(NC;sc-37007)si RNA使用Hi Per Fect干扰试剂,依据说明书进行。将细胞铺在2 m L完全生长培养基中,旨在si RNA转染时,细胞达到30-50%的融合度。通过上调和下调FAM53A蛋白表达,为后续细胞功能学实验、以及寻找FAM53A在乳腺癌中的相关通路提供基础。5.细胞增殖和集落形成测定将细胞于无菌六孔培养板中培养,转染或干扰FAM53A,改变其蛋白表达水平,运用MTT试验检测FAM53A对乳腺癌细胞增殖能力的影响。经MTT处理后检测其在490 nm波长的吸光度值,绘制生长曲线。对于集落形成实验,将细胞于无菌六孔培养板中培养,改变FAM53A的蛋白表达水平,然后进行细胞计数,将细胞以1000个细胞/皿的密度接种在40mm的培养皿中并孵育10-15天。每3天更换相应的含有10%胎牛血清的培养基。收取培养皿,经过固定、染色等步骤,计数细胞集落形成的数量和大小,以此来衡量FAM53A对乳腺癌细胞增殖能力的影响。在相同条件下至少进行3次独立实验。6.细胞迁移和侵袭实验将细胞于无菌细胞六孔培养板中培养,转染或干扰FAM53A,改变其蛋白表达水平,准备无菌的孔径为8μm的24孔transwell小室进行细胞迁移和侵袭实验。对于细胞迁移实验测定,将上述细胞进行计数,按组间相同的乳腺癌细胞数量铺于transwell小室的上室,将补充有10%FBS的培养基作为化学引诱剂添加到下室中。18小时后取出transwell小室,用棉签去除上室细胞,经过固定、染色等步骤,对下室细胞进行计数,下室细胞数量的多少反映出FAM53A对乳腺癌细胞迁移能力的影响。对于细胞侵袭实验测定,将transwell小室上室用100μL基质胶包被,同样对上述细胞进行计数,按组间相同的乳腺癌细胞数量铺于transwell小室的上室,将补充有10%FBS的培养基作为化学引诱剂添加到下室中。继续培养18小时之后,取出transwell小室,步骤同上。在相同条件下,所有实验独立重复至少三次。7.Western blot检测转染或干扰FAM53A,改变其蛋白表达水平后,收集细胞加入细胞裂解液保持在冰上裂解。蛋白浓度采用Bradford方法进行总蛋白浓度测定。配样后,用等量蛋白上样,运用SDS-PAGE进行蛋白分离,然后转印至PVDF膜上。室温下封闭2小时,一抗4°C孵育过夜。第二天,二抗室温孵育2小时,用ECL发光并拍照。结果用Image J软件进行条带灰度值测定。通过Western blot检测对细胞增殖、迁移、侵袭有关的蛋白进行检测和分析,找出FAM53A影响乳腺癌的相关通路。8.通过分析Western blot检测结果,我们找出FAM53A可能通过MEK/ERK信号通路影响乳腺癌,为了证实FAM53A的确是通过MEK/ERK信号通路发挥作用,在已有的对该信号通路作用的基础上,选取特异性MEK/ERK信号通路抑制剂PD98059,来抑制该通路对下游功能的影响,从而反向验证我们的结论。结果:1.FAM53A定位于细胞质和细胞核中,在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中低表达,而在p53突变型乳腺癌细胞MDA-MB-231高表达。临床病理相关性分析中,FAM53A水平与野生型p53呈负相关。2.在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中,FAM53A过表达时,细胞的增殖,迁移和侵袭能力显著降低,而当FAM53A表达下调时,则导致MCF-7的增殖,迁移和侵袭增强。FAM53A能够调控MCF-7细胞增殖,迁移,侵袭相关功能蛋白。3.在p53突变型乳腺癌细胞MDA-MB-231中,FAM53A过表达促进了细胞的增殖,迁移和侵袭,而下调FAM53A抑制MDA-MB-231的增殖,迁移和侵袭。FAM53A能够调控MDA-MB-231细胞增殖,迁移,侵袭相关功能蛋白。4.在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中,FAM53A负向调控EMT相关蛋白,而在p53突变型乳腺癌细胞MDA-MB-231中,FAM53A促进EMT。5.FAM53A通过MEK/ERK途径影响乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭,并调控EMT。6.改变MCF-7和MDA-MB-231细胞的p53状态,原有的对细胞增殖,迁移和侵袭以及对EMT的影响也随之改变。结论:1.FAM53A在乳腺癌细胞中的表达与p53呈负相关2.FAM53A抑制p53野生型乳腺癌细胞MCF-7的增殖,迁移和侵袭;而促进p53突变型乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖,迁移和侵袭3.FAM53A通过MEK/ERK信号通路调节乳腺癌细胞4.FAM53A对MCF-7和MDA-MB-231细胞相反的调控作用取决于它们p53的状态。