研究背景皮肤是人体最大的器官,作为机体与外界的屏障发挥着重要作用。它保护机体免受物理性、机械性、化学性和病原微生物的侵袭;阻止体内水、电解质及各种营养物质的大量流失;感知各种感觉,引起相应的神经反射,使人远离有害刺激;其内的角质层、毛囊、皮脂腺和汗管具有吸收功能,也能分泌汗液、皮脂等;皮肤也是体温调节系统的重要组成部分;同时它还是免疫和心理器官。总而言之,皮肤对维系人的身心健康起着不可替代的作用。然而,在现代社会中,与皮肤有关的创面问题却是临床上最常见的病症之一,交通伤、事故伤、压力性溃疡、血管病变性创面和烧伤等诸多疾病或多或少都存在皮肤缺损的问题。通常,创面的处理是在保证创面清洁干净的基础上,对因对症进行治疗,但不论哪种治疗都离不开创面覆盖物的辅助,作为临床上最常见的医疗耗材,创面敷料对创面愈合起着重要的作用。目前,临床上使用的创面敷料种类很多,但是普遍存在结构单一,价格昂贵等问题。热塑性聚氨酯弹性体,英文名Thermoplastic polyurethanes elastomer,简称TPU,是一种综合性能优异的有机高分子材料。TPU具有良好的化学稳定性和易加工性;同时兼具优异的生物相容性,早已经通过FDA(Food and Drug Administration,美国食品药品监督管理局)的认证并广泛运用于医疗产品的制备中;而且TPU价格低廉,在成本控制方面具有显著优势。理论上讲,TPU可用作创面敷料的制备,但目前国内外均尚未出现利用TPU来制备创面敷料的相关报道。1962年,Winter教授提出了湿性创面愈合理论,经过几十年的发展,如今单纯地以湿性愈合原理作为指导而研发的敷料已越来越少,采用新型的生物材料和现代化的制造技术、结合细胞和生长因子、在结构和功能上模仿正常皮肤已成为创面敷料研发的新方向。TIPS(Thermally induced phase separation,热致相分离法)是当前制备高分子多孔膜最常见的方法,在本课题中,我们根据前期的研究成果,在传统工艺的基础上,对制备TPU多孔膜的方法进行改进,采用新型粒子沥虑-浸没沉淀法对TPU进行加工,成功地制备了具有仿生结构的TPU多孔膜。已有文献证实双层敷料对细胞的增殖和创面组织的修复有促进作用,结合TPU多孔膜良好的理化性质及仿生的结构,我们预测仿生TPU多孔膜用作创面覆盖物能对创面的愈合起到积极的作用。目的本研究以TPU为原料,采用粒子沥虑-浸没沉淀法制备具有仿生结构的TPU多孔膜;在此基础上,测试仿生TPU多孔膜相关物理表征、生物相容性以及对创面愈合的影响。我们希望此研究能够为临床上创面的治疗提供一个新的选择,同时进一步拓宽TPU材料的应用范围。方法1.TPU多孔膜的制备:通过TIPS法制备普通TPU多孔膜;通过粒子沥虑-浸没沉淀法制备仿生TPU多孔膜。2.TPU多孔膜的观察及表征的测定:(1)观察两种不同TPU多孔膜的外观及微观结构。(2)计数孔的数量和测量孔径大小,测定多孔膜的拉伸强度、断裂伸长率及水蒸气透过率。3.TPU多孔膜的细胞毒性:实验方法参考GB/T 16886.5,将TPU多孔膜的浸提液与人成纤维细胞共培养,设立阴性、阳性及空白对照组,在细胞接种后第1天、3天、5天和7天,观察各组的细胞形态并检测细胞数量。4.TPU多孔膜对创面愈合的影响:(1)在Balb/c小鼠的背部制造直径为4㎜的皮肤全层缺损,使用仿生TPU多孔膜、普通TPU多孔膜、凡士林纱布作为创面覆盖物,并设置空白对照组,观察比较各组小鼠在设定时间点创面愈合的情况。(2)在致创后第3天及第7天,对创面组织进行取材并固定,制备病理切片,采用HE染色(Hematoxylin-eosin staining,苏木素-伊红染色),对切片进行观察并记录,利用Image J 1.50i(图像处理软件)测量新生上皮长度及肉芽组织厚度。(3)在致创后第5天,对创面组织进行取材并提取蛋白,WB(Western blot,蛋白印迹法)检测创面组织中PCNA(Proliferating cell nuclear antigen,增殖细胞核抗原)及CD31(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,血小板-内皮细胞粘附分子)的表达。结果1.仿生TPU多孔膜在外观、拉伸强度、断裂伸长率及水蒸气透过率上均优于普通TPU多孔膜;除此之外,仿生TPU多孔膜外表面的孔径为微米级,孔径上小下大,内部呈海绵状,在一定程度上模拟了人体正常皮肤结构。我们测得这一批次的仿生TPU多孔膜厚度为2.08㎜,上下表面的孔径分别为2.11±0.62μm和92.18±18.36μm;普通TPU多孔膜厚度为2.20㎜,上下表面的孔径分别为0.20±0.16μm和36.57±14.70μm。2.浸提液与人成纤维细胞共培养后第1天、3天、5天和7天,普通TPU多孔膜组和仿生TPU多孔膜组与阴性对照组和空白对照组相比,细胞形态无明显差别,细胞的相对数量(OD值)无统计学差异,表明其在数量上增殖趋势一致,提示TPU多孔膜敷料生物相容性良好。3.在动物实验中,空白对照组、凡士林纱布组、普通TPU多孔膜组及仿生TPU多孔膜组创面愈合的平均时间分别是9.5±0.55天、9.3±0.52天、8.68±0.82天和7.14±0.41天,说明仿生TPU多孔膜用作创面覆盖物,与其他各实验组相比,能显著缩短创面的愈合时间。4.在创后第3天及第7天,仿生TPU多孔膜组的新生上皮长度分别是1052±317μm与2414±703μm,普通TPU多孔膜组的分别是644±176μm与1920±654μm,凡士林纱布组的分别是481±119μm与1570±506μm,空白对照组的分别是446±143μm与1416±610μm;致创后第7天,各实验组创面肉芽组织的厚度,分别是501±168μm、415±113μm、607±68μm及803±118μm。说明在致创后第3天及第7天,仿生TPU多孔膜组创面新生上皮长度明显长于其他各组;在致创后第7天时,其肉芽组织厚度也显著大于其他实验组。5.在致创后第5天,仿生TPU多孔膜组创面组织中的PCNA及CD31的表达强度明显高于空白对照组、凡士林纱布组及普通TPU多孔膜组,提示仿生TPU多孔膜可促进创周细胞的增殖和创面新生组织的血管化。结论在本研究中,我们改进了制备TPU多孔膜的工艺,采用新型粒子沥虑-浸没沉淀法成功地制备了仿生TPU多孔膜。与传统方法制备的产品相比,采用新方法制备的TPU多孔膜除了在外观、力学性质及水蒸气透过率上具有明显优势外,其结构更是具有仿生的特性—外表面孔径为微米级,具有防止细菌入侵的屏障作用,内部的海绵结构,可作为储藏池引流吸收渗液,内表面的大孔径有利创面细胞的增殖和组织的修复。除此之外,仿生TPU多孔膜具有良好的生物相容性。在小鼠皮肤全层创面愈合的实验中,仿生TPU多孔膜覆盖创面的愈合时间明显短于普通TPU多孔膜组,凡士林纱布组及空白对照组。同时,我们发现使用仿生TPU多孔膜作为敷料的创面上皮化速度及肉芽组织厚度明显大于对照组。WB结果显示仿生TPU多孔膜能增强创面PCNA及CD31的表达。