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前 言肾小球硬化是临床多种肾小球疾病,如肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病肾病及狼疮性肾炎等引起患者慢性肾功能衰竭的重要病理基础,其主要病理特征是肾小球结构的毁损以及肾小球内ECM的异常积聚,而ECM合成和(或)降解失衡被认为是导致肾小球硬化的重要发生机制。因此,近年来的研究热点已逐渐集中到ECM代谢的调控机制,以及与肾小球硬化发生、发展的相互关系上。TGF-β1是一个多功能细胞因子,在细胞增殖、发育、分化、凋亡、及免疫调节过程中都发挥着重要作用。TGF-β1也是ECM代谢的一个重要调节因子,但其促进肾小球病变发生发展或硬化的发生机制仍在深入研究之中,尤其是TGF-β1在调节ECM合成和降解过程中所涉及的细胞内信号转导机制尚未完全阐明。Smad蛋白家族的发现无疑为TGF-β1细胞内信号转导机制的进一步阐明提供了重要依据。最新研究表明,Smads蛋白是TGF-β1与其细胞表面丝/苏氨酸激酶受体结合后,将其信号从细胞膜传递到细胞核过程中极其重要的细胞内信号介导分子。在哺乳动物细胞中,其家族可分为3大类:一是受体激活Smad(R-Smads),包括Smad1、2、3、5和Smad8;二是共同通路Smad(Co-Smad),即Smad4;三是抑制性Smad(I-Smad),包括Smad6和Smad7。本课题拟采用细胞基因转染技术,观察TGF-β1/Smad信号转导通路对体外培养的大鼠肾MsC ECM组分、基质金属降解酶及其抑制剂系统表达的影响;深入探讨Smad与MAPK信号转导系统在TGF-β1介导的Smad7基因转录过程中存在的串话(cross-talk),为进一步阐明 TGF-β1/Smad信号通路在肾小球硬化发生中的作用,并为开展对肾小球疾病动物模型的基因治疗提供理论和实验依据。 <WP=6>第一部分 R-Smads、Smad4基因转染对大鼠肾MsC ECM代谢的影响目的 探讨R-Smads,即Smad2、Smad3和Smad4在TGF-β1作用下对大鼠肾MsC ColⅠ、Ⅳ、FN和MMP-2/TIMP-2蛋白表达和(或)酶活性的影响。方法 采用脂质体介导法,分别将Smad2、3和Smad4基因瞬时转染体外培养的MsC,并用免疫荧光、RT-PCR和Western blot法检测其转染成功与否;再分别用Western blot、明胶酶谱法或反式明胶酶谱法,观察转基因MsC在TGFβ1作用下ColⅠ、Ⅳ、FN和MMP-2/TIMP-2 蛋白表达和(或)酶活性的改变。结果 转染Smad2、3基因的MsC,TGFβ1促进ECM合成的作用受到明显促进,表现为ColⅠ蛋白水平分别升高1.6倍和1.7倍(P<0.01),Col Ⅳ蛋白水平分别升高2.1倍和2.3倍(P<0.01),而FN的表达无显著变化。转染Smad4基因的MsC经TGFβ1作用后,其ColⅠ、Ⅳ蛋白表达明显增强,分别升高1.8倍和3.3倍(P<0.01)。转染Smad2基因的MsC,MMP-2和TIMP-2 蛋白表达和酶活性均略有升高,经TGFβ1作用后有明显升高,蛋白表达分别增加2.8倍和3.0倍,酶活性分别提高3.0倍和1.7倍(P<0.01)。转染Smad3基因的MsC,TIMP-2 蛋白表达和酶活性略有升高,TGFβ1作用后升高更为明显,蛋白表达增强2.9倍,酶活性提高1.8倍(P<0.01);而MMP-2蛋白表达和酶活性均无明显变化。小结 转染Smad2、3和Smad4基因后,可促进TGFβ1对MsC ColⅠ、Ⅳ蛋白表达的上调作用,而FN蛋白表达则无显著变化;转染Smad2基因后,TGFβ1上调MsC MMP-2和TIMP-2 蛋白表达和酶活性的作用均受到明显促进;而转染Smad3基因后,TGFβ1上调MsC TIMP-2 蛋白表达和酶活性的作用受到明显促进,MMP-2蛋白表达和酶活性均无明显变化。第二部分 Smad7基因转染对大鼠肾MsC ECM代谢的影响目的 探讨Smad7信号蛋白在TGF-β1作用下对大鼠肾MsC ColⅠ、Ⅳ和MMP-2/TIMP-2蛋白表达和(或)酶活性的影响。方法 采用脂质体介导法,将Smad7基因瞬时转染体外培养的MsC,分别用Western blot、明胶酶谱法或反式明胶酶谱法,观察在TGFβ1作用下,转基因<WP=7>MsC ColⅠ、Ⅳ和MMP-2/TIMP-2蛋白表达和(或)酶活性的改变。结果 转染Smad7基因的MsC,TGFβ1促进其胶原蛋白合成的作用受到显著抑制,表现为ColⅠ、Ⅳ蛋白水平分别降低1.7倍和2.4倍(P<0.01);转染Smad7基因的MsC, TGFβ1上调MMP-2、TIMP-2蛋白分泌和酶活性的作用均受到明显抑制,蛋白表达分别降低2.2倍和2.1倍(P<0.01),酶活性分别下降2.8倍和1.5倍(P<0.01)。小结 转染Smad7基因后,TGF-β1促进MsC胶原蛋白合成的作用受到显著抑制,表现为ColⅠ、Ⅳ蛋白水平明显降低;同时,TGF-β1上调MsC MMP-2、TIMP-2蛋白分泌和酶活性的作用也均受到明显抑制。第三部分 Smad与MAPK信号通路对Smad7基因转录的共同调节作用目的 探讨Smad与MAPK信号通路在TGFβ1介导的内源性Smad7基因转录过程中的共同调节作用。方法 将Smad3基因瞬时转染体外培养的MsC;采用半定量RT-PCR检测Smad3对TGFβ1介导的内源性Smad7基因转录的影响;采用EMSA 观察Smad3/ Smad4转录因子复合物以及转录因子AP-1对Smad7基因的转录调控作用。结果 在TGF-β1作用下,内源性Smad7基因转录水平明显升高;转染Smad3基因后,TGFβ1介导的内源性Smad7基因转录作用明显增强。EMSA结果显示,经TGFβ1作用后,Smad3/ Smad4转录因子复合物与DIG标记的SBE探针的结合活性明显增强;而TGFβ1作用前后,转录因子AP-1与DIG标记的AP-1探针的结合活性无明显变化。小结 TGFβ1可促进内源性Smad7基因转?