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研究背景：腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)是终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)患者肾脏替代治疗的重要手段之一,其长期存活率和生存质量与血液透析相当,且具有相对经济,操作简易,较好保护残肾功能等优势,是非常适合中国国情的一种治疗手段。但是长期暴露在生物不相容的腹透液中,腹膜将发生组织结构改变,引起腹膜纤维化,进一步导致超滤衰竭(ultrafiltration failure, UFF),在一定程度上限制了腹膜透析的长期及广泛应用。目前腹膜纤维化的分子机制尚不明确,但近年来的研究表明,腹膜间皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)作为腹膜纤维化的早期和可逆环节在腹膜纤维化中起着非常重要的作用。小分子RNA (microRNA, miRNA)是新近发现的一类长度约21-25个核苷酸的非编码RNA分子。miRNA在细胞生命活动中发挥着重要作用,直接调节哺乳动物基因组中30%以上蛋白编码基因的转录。最新的研究表明,miRNAs参与调节多种组织细胞EMT过程,靶向miRNA可以有效逆转EMT并抑制器官纤维化,包括心脏、肝脏、肺、肾纤维化,系统性硬化等。研究表明miRNA不仅可作为治疗靶点还可能是新型的诊断标志物。然而,miRNA在腹膜间皮细胞EMT和腹膜纤维化中的作用尚不清楚。miRNA-29家族包括miRNA-29a/b/c,是目前发现的一个与多种纤维化疾病密切相关的小分子RNA家族。本课题组之前的miRNA芯片研究(microarray)显示,与新开管患者相比,透析时间>6个月的腹膜透析患者腹膜间皮细胞多个miRNA异常表达,其中miRNA-29c表达明显增加。同时我们发现随着透析时间的延长腹膜间皮细胞EMT改变明显,我们推测mRNA-29c可能与腹膜间皮细胞EMT产生有关,但具体机制尚不明确,为此,本实验开展如下研究。目的：检测不同透析时间PD患者流出液腹膜间皮细胞中miRNA-29c的表达水平,探讨miRNA-29c与腹膜间皮细胞EMT的相关性。方法：选取24例我院门诊及住院PD患者,分为新开管组(PD≤30天)和PD≥1年组,收集患者过夜留腹腹膜透析液后分离培养鉴定流出液中腹膜间皮细胞；用real-time PCR Taqman探针法检测腹膜间皮细胞niRNA-29c的表达水平；Western-blot, real-time PCR法检测腹膜间皮细胞中E-钙连素(E-cadherin)、α-肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、胶原蛋白(Collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ),纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的农达。结果：1.新开管组患者腹膜透析流出液中分离培养的腹膜间皮细胞形状以鹅卵石样多见而PD≥1年组患者腹膜间皮细胞纤维样变；2.腹膜透析流出液分离培养的细胞中CD45-/CD68-/cytokeratin+细胞占总细胞比例为93.61±2.52%；3.与新开管组相比,PD≥1年组患者腹膜透析流出液分离培养的腹膜间皮细胞miRNA-29c表达明显增高；4.与新开管组相比,PD≥1年组患者腹膜透析流出液分离培养的腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达明显下降,而α-SMA、 Col-Ⅰ, FN mRNA及蛋白表达明显增加；5.PD患者腹膜透析流出液中腹膜间皮细胞miRNA-29c表达水平与E-cadherin mRNA水平负相关,而与α-SMA、Col-Ⅰ, FN inRNA表达水平呈正相关。结论：不同透析时间PD患者腹膜透析流出液分离培养的腹膜间皮细胞存在形态学差异；长期PD患者流出液腹膜间皮细胞呈间充质转分化,且miRNA-29c表达较新开管患者显著升高,提示miRNA-29c可能与腹膜间皮细胞EMT有关。目的：研究miRNA-29c在高糖诱导的人腹膜间皮细胞株(HMrSV5细胞)EMT中的作用及机制,探讨干预腹膜间皮细胞EMT的方法。方法：用不同浓度(30,60,90mM D-葡萄糖)高糖处理HMrSV5细胞(以含5.6mM葡萄糖的普通培基作为正常对照,90mM甘露醇为等渗对照),倒置显微镜下观察细胞形态变化。Western blot, real-timePCR检测高糖刺激下HMrSV5细胞中E-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ、FN及miRNA-29c的表达水平；用60mM D-葡萄糖处理HMrSV5细胞不同时间点(0,12,24,48h)后Western blot, real-time PCR检测HMrSV5细胞E-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ、FN及miRNA-29c的表达。转染miRNA-29c抑制剂(miRNA-29c inhibitor)及阴性对照(miRNA-29c inhibitor negative control)后,细胞免疫荧光、Western blot及real-timePCR检测高糖刺激下HMrSV5细胞E-cadhern、α-SMA、Col-Ⅰ、 FN的表达。结果：1.和正常对照及等渗对照组相比,高糖刺激24h后HMrSV5细胞由圆形、椭圆形向纤维状改变,以60,90mM高糖刺激最明显；2.与正常对照组相比,高糖抑制HMrSV5细胞E-cadherin蛋白及mRNA表达而促进HMrSV5细胞α-SMA、Col-Ⅰ,FN蛋白及mRNA表达,均呈浓度和时间依赖性；3.与正常对照组相比,高糖促进HMrSV5细胞miRNA-29c表达,呈浓度和时间依赖性；4.抑制miRNA-29c表达后,可上调高糖组HMrSV5细胞E-cadherin蛋白和mRAN表达,而下调α-SMA、Col-Ⅰ及FN蛋白和mRAN表达。结论：高糖诱导HMrSV5细胞EMT的发生；高糖促进HMrSV5细胞miRNA-29c表达上调；下调miRNA-29c的表达可抑制HMrSV5:细胞EMT,提示miRNA-29c介导高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT。目的：检测：miRNA-29c下游靶基因Spry-1在腹膜间皮细胞EMT中的表达,探讨miRNA-29c调节腹膜间皮细胞EMT发生的可能机制。方法：Western blot及real-time PCR检测不同透析时间PD患者腹膜透析流出液分离培养的腹膜间皮细胞中Spry-1的表达；Western blot及real-time PCR检测不同浓度(30,60,90mM D-葡萄糖)高糖刺激下及60mM D-葡萄糖刺激不同时间后(0,12,24,48h)HMrSV5细胞Spry-1的表达；转染miRNA-29c抑制剂及阴性对照后,细胞免疫荧光、Western blot, real-time PCR检测高糖刺激下HMrSV5细胞Spry-1的表达。结果：1.与新开管组患者相比,PD≥1年组患者腹膜透析流出液分离培养的腹膜间皮细胞中的Spry-1表达水平降低；2.与正常对照相比,高糖抑制HMrSV5细胞Spry-1表达,呈浓度和时间依赖性；3.抑制miRNA-29c表达后,可促进高糖组HMrSV5细胞Spry-1蛋白表达。结论：长期PD患者腹膜透析流出液腹膜间皮细胞中Spry-1表达下降；高糖抑制HMrSV5细胞中Spry-1表达；抑制miRNA-29c促进高糖组HMrSV5细胞中Spry-1表达,提示miRNA-29c可能通过调控Spry-1介导高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT。