[研究背景]薄型子宫内膜（thin endometrium,TE）是指子宫内膜的厚度低于能够获得妊娠的阈值,目前公认的是6-7mm。关于薄型子宫内膜的病因,目前多数研究认为与反复宫腔操作、感染、子宫动脉栓塞后子宫内膜供血不足有关,可能与持续口服避孕药、克罗米芬促排卵的应用等有关。子宫内膜容受性即母体子宫内膜接受胚胎的能力,胚胎只有在着床窗口期才能完成定位黏附植入,这一时期子宫内膜发生了特殊的形态、生理和分子生物学的变化来易化胚胎植入。薄型子宫内膜不仅影响子宫内膜容受性影响胚胎种植致妊娠率低,还增加产科并发症的发生,如何改善薄型子宫内膜（中重度宫腔粘连、人工助孕治疗中反复子宫内膜薄）的子宫内膜容受性是当今生殖医学研究的热点和难点。雌激素阴道给药直接作用子宫等靶器官,避免了胃肠吸收和肝脏首过效应,还可避免雌二醇（E2）在肠、肝脏被转化为雌酮（E1）,使E2/E1更接近生理比值,同时维持稳定的血药浓度。阴道长约8-12cm,表面的皱褶不仅使阴道具有较好的扩张性,同时使其吸收面积提高到了 95cm2。阴道周围布满动静脉网,使得药物迅速、便利地吸收入血,直接作用于子宫等靶器官。阴道给药可减少乳房胀痛等全身副反应的发生率,从而会增加患者的依从性。雌激素阴道给药因其以上优势被逐渐应用于生殖领域,尤其疑难病例的改善中,如有生育要求的重度宫腔粘连分离术后内膜修复、反复移植失败、难治性薄型子宫内膜等。国内外雌激素阴道用药的研究多局限于生殖领域的临床应用、围绝经期妇女的基础研究及临床应用,目前尚无雌激素阴道给药用于薄型子宫内膜的系统研究报道,所以临床上尚未建立雌激素阴道给药方案和治疗常规,如果针对雌激素阴道给药的临床应用及作用机制进行总结分析,这将使我们全面了解雌激素阴道给药对于子宫内膜环境及容受性的影响,会对临床上解决薄型子宫内膜患者的生育难题提供关键的支持。本研究首先招募子宫内膜不受自身雌激素影响的卵巢早衰患者给予阴道给药和口服给药雌二醇,初步研究雌激素阴道给药对于人薄型内膜容受性的影响,其后通过薄型子宫内膜大鼠模型研究进一步观察阴道给药对于薄型子宫内膜的修复作用及可能的相关机制,最后观察雌激素阴道给药在临床中的应用效果。本研究分为四个部分,第一部分:雌孕激素阴道给药改善薄型子宫内膜容受性的初步研究;第二部分:雌激素阴道给药改善薄型子宫内膜大鼠模型内膜环境及容受性的相关机制研究;第三部分:雌激素阴道给药在中重度宫腔粘连分离术后的临床应用;第四部分:雌激素阴道给药在薄型子宫内膜冻融胚胎移植周期中的临床应用。第一部分雌孕激素阴道给药改善薄型子宫内膜容受性的初步研究[目的]比较雌孕激素阴道和口服给药在薄型子宫内膜增殖和分泌转化及内膜容受性中的作用。[方法]招募卵巢早衰患者30人,采用随机数字表法随机分为两组,A组口服给予2mg雌二醇/地屈孕酮,B组阴道给予1mg雌二醇/地屈孕酮,序贯28天。分别于给药14和21天时抽血化验激素水平、阴道超声测量内膜厚度及内膜血流、一次性宫腔组织吸引管吸取子宫内膜组织通过HE染色、扫描电镜、免疫组织化学检测进行内膜组织形态、功能学评价。[结果]1.激素水平测定给药14天和给药21天,阴道给药组的血E2水平明显高于口服组（P＜0.001）;其FSH和LH水平较用药前下降幅度更大（P＜0.05）。给药14天,阴道给药组的内膜组织E2水平明显高于口服组及正常对照人群排卵期（P＜0.001）。2.超声检测结果给药14天和给药21天,阴道给药组的内膜厚度明显高于口服组（P＜0.001）。给药14天,其子宫内膜血流参数PI、RI低于口服给药组（P＜0.05）。3.内膜组织常规HE染色形态学检测给药14天时,阴道给药组多呈增殖中晚期改变,而口服组内膜呈增殖中期改变。给药21天时,阴道给药组内膜呈分泌中期改变,而口服给药组内膜呈分泌早期改变。比较两组NIS-Elements图像分析系统采集图像结果示:给药14天和21天时,阴道给药组子宫内膜的腺体周长、腺体总面积、腺上皮细胞面积、腺上皮平均高度、腺腔面积、腺体百分比、腺上皮和腺腔百分比均高于口服给药组,差异有统计学意义（P＜0.05）。4.两组子宫内膜组织容受性因子ER、PR、LIF、Integrin β 3、MMP9、VEGF表达水平比较给药14天和21天时,阴道给药组的内膜腺体和间质ER表达水平均高于口服组（P＜0.05）。给药14天时,阴道给药组的内膜腺体和间质PR表达水平均低于口服给药组,差异无统计学意义（P＞0.05）。给药21天时,阴道给药组的内膜腺体PR表达水平低于口服给药组,间质的PR表达水平高于口服给药组,差异均无统计学意义（P＞0.05）。给药14天时,阴道给药组的间质VEGF表达水平高于口服给药组,差异有统计学意义（P＜0.05）。两组间腔上皮、腺上皮和间质的LIF、Integrin β 3、MMP9表达水平无明显差异（P＞0.05）。给药21天时,阴道给药组的腔上皮LIF、Integrin β 3、MMP9、VEGF表达水平高于口服给药组,但仅LIF表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。5.两组内膜组织细胞表面胞饮突发育情况比较给药21天时,两组均无成熟期的胞饮突出现。阴道给药组细胞表面发育期的胞饮突样本数量多于口服给药组（P=0.025）。[结论]1.雌激素阴道给药后经阴道黏膜吸收,外周血雌二醇水平明显升高,局部内膜组织的雌二醇水平明显升高,提示雌激素吸收效率更高。2.阴道给予低剂量雌二醇即可使子宫内膜由超薄型闭经状态内膜充分转化为增殖中晚期内膜。3.阴道添加地屈孕酮7天后,子宫内膜形态转化为分泌中期内膜,内膜ER、PR表达下调,内膜容受性因子（LIF、Integrinβ 3、MMP9、VEGF）表达不同程度地上调,且内膜细胞表面胞饮突发育明显地改善,证实阴道给予地屈孕酮可以有效地促进子宫内膜由增殖期向分泌期转化,并使内膜容受性发生相应改变。4.雌二醇/地屈孕酮阴道给药对于薄型子宫内膜容受性的改善作用优于口服给药。第二部分雌激素阴道给药改善薄型子宫内膜大鼠模型内膜环境及容受性的相关机制研究[目的]构建薄型子宫内膜大鼠模型,观察雌激素阴道给药对子宫内膜厚度、腺体增生及血管再生的影响及Wnt/β-catenin信号通路在子宫内膜血管再生中的调控作用,进一步寻找Wnt家族中具体影响该调控作用的Wnt基因。[方法]1.选取动情周期的SD雌性大鼠64只,分为空白对照组、模型对照组、模型+低剂量雌激素阴道给药组、模型+高剂量雌激素阴道给药组,每组16只。除空白对照组外,余3组均采用95%乙醇化学损伤法损伤右侧子宫构建大鼠薄型子宫内膜模型。术后8天,开始阴道给予雌二醇,剂量为0.09 mg/kg.d（低剂量组,采用动物试验等效剂量换算相当于60kg成人1mg雌二醇）、0.18mg/kg.d（高剂量组,相当于60kg成人2mg雌二醇）,连续12天。12天后每组处死8只,测定血清及子宫组织E2水平;HE染色观察子宫内膜组织形态变化;免疫组织化学分析各组大鼠子宫内膜组织Wnt3a、β-catenin、VEGFA、MMP9、CD31、CK18、CK19、Vimentin 表达情况;RT-PCR 技术定量分析 Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、β-catenin、VEGFA、MMP9 mRNA 表达特征;Western-blot 法检测 Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、VEGFA、MMP9蛋白的表达。各组大鼠于术后24d与雄鼠2:1合笼,于合笼后11-14天处死大鼠计数孕囊数。2.体外培养人子宫内膜基质细胞（hESCs）,添加雌激素并行SiRNA干扰Wnt3a后通过RT-PCR技术及Western-blot法观察下游信号转导通路β-catenin、VEGFA的表达变化。[结果]1.与空白对照组及模型组比较,雌激素阴道给药后血清及子宫内膜组织E2水平均明显升高（P＜0.01）。与低剂量组相比,高剂量组血清及子宫内膜组织E2水平明显增高（P＜0.05）。子宫内膜厚度及形态:与空白对照组比较,模型组腺体及血管稀疏,间质细胞明显减少,内膜明显变薄（P＜0.05）;与模型组比较,雌激素给药组间质细胞增多,腺体、血管增多,内膜增厚（P＜0.05）,高低剂量组组间无明显差异。免疫组织化学检测:与空白对照组比较,模型组子宫内膜CD31、CK18、CK19、Vimentin均表达下降（P＜0.05）;与模型组比较,雌激素给药组CD31、CK18、CK19、Vimentin表达均升高（P＜0.05）,高低剂量组组间无明显差异。RT-PCR检测:与空白对照组相比,模型组β-catenin、VEGFA、MMP9 mRNA含量均降低（P＜0.05）;而与模型组相比,雌激素给药组β-catenin、VEGFA、MMP9 mRNA含量均升高（P＜0.05）;高剂量组比低剂量组含量有增加,但无统计学意义。各组WNT4、WNT6 mRNA含量均无明显差异;而与对照组相比,模型组WNT3a、WNT5a mRNA含量均降低;与模型组相比,雌激素给药组WNT3a、WNT5a mRNA含量均升高。Western-blot检测:与空白对照组相比,模型组Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、VEGFA、MMP9蛋白水平均降低（P＜0.05）;而与模型组相比,雌激素给药组Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、VEGFA、MMP9蛋白水平均升高（P＜0.05）,高剂量组比低剂量组含量略有增加。其中,Wnt3a 比Wnt5a蛋白水平显著升高（P＜0.05）。免疫组织化学检测:与空白对照组相比,模型组Wnt3a、β-catenin、VEGFA、MMP9表达均降低（P＜0.05）;雌激素给药组Wnt3a、VEGFA、β-catenin、MMP9表达均上调（P＜0.05）;高剂量组上调较低剂量升高,但无统计学差异。妊娠试验:与模型组损伤侧相比,空白对照组及雌激素给药组损伤侧孕囊数均明显增多（P＜0.05）,未损伤侧孕囊数无明显差异。与低剂量给药组相比,高剂量给药组孕囊数增多,但无统计学意义（P＞0.05）。2.细胞试验:RT-PCR检测:体外培养人子宫内膜基质细胞（hESCs）,添加雌激素后,Wnt3a、β-catenin、VEGFA mRNA 含量均有不同程度升高（P＜0.05）;Wnt3a 在siRNA转染细胞后其在加雌激素和不加雌激素组的表达量较未转染组明显降低（P＜0.05）,说明干扰成功;下流目标基因β-catenin、VEGFA mRNA含量在转染组均明显降低（P＜0.05）。Western-blot 检测:添加雌激素后,Wn3a、β-catenin、VEGFA 蛋白表达均有不同程度升高（P＜0.05）;Wnt3a在siRNA转染细胞后其在加雌激素和不加雌激素组的表达量较未转染组明显降低（P＜0.05）,说明干扰成功;下流目标基因β-catenin、VEGFA蛋白表达量在转染组均明显降低（P＜0.05）。[结论]1.雌激素阴道给药能够提高薄型子宫内膜大鼠血清及子宫内膜组织E2水平,增加子宫内膜厚度、腺体及血管数量,提高子宫内膜组织CD31、CK18、CK19、Vimentin表达,并最终增加大鼠妊娠孕囊数。2.雌激素阴道给药通过Wnt/β-catenin通路上调薄型子宫内膜大鼠子宫内膜VEGFA、MMP9的表达,促进薄型子宫内膜的修复,这种作用可能通过WNT家族中WNT3a进行调控。第三部分雌激素阴道给药在中重度宫腔粘连分离术后的临床应用[目的]观察中重度宫腔粘连分离术后雌激素阴道给药修复内膜的临床效果[方法]有生育要求的女性,经宫腔镜检查确定为中重度宫腔粘连,宫腔粘连分离术后放置子宫输卵管造影管5天,术后即口服雌二醇,4mg/d,7天后随机分为两组,A组口服雌二醇4 mg/d,连续14天,后加用地屈孕酮20mg,连续14天;B组阴道给予雌激素1mg/d,连续14天,后加用地屈孕酮10mg,连续14天。待月经来潮后于第4天继续前一周期用药方案,连续2个月。第3个周期随访月经量变化并于给药14天时阴道超声测量内膜厚度及子宫内膜血流分型。根据内膜恢复情况适时指导受孕,随访24个月,记录妊娠情况。比较两组患者治疗前、后子宫内膜的厚度变化,血清雌二醇水平及临床妊娠率等。[结果]本研究共纳入98例患者,宫腔操作史占98.98%（97/98）,其中流产清宫史者73例,其中因稽留流产清宫者34例。两组疗效比较:术后月经量改善92例,占患者总人数的93.88%（92/98）,其中阴道给药组月经量改善比例（97.96%）高于口服给药组的（89.8%）,但是差异无统计学意义（P＞0.05）。宫腔粘连分离术后3个月阴道给药组子宫内膜厚度及增加幅度均高于口服给药组,差异有统计学意义（P＜0.05）。子宫内膜血流分型:术后3个月阴道给药组子宫内膜血流分型优于口服给药组（P＜0.05）。术后随访24个月临床妊娠56例,阴道给药组临床妊娠率（65.31%,32/49）高于口服给药组（48.98%,24/49）,但是差异无统计学意义（P＞0.05）。[结论]1.宫腔操作史是宫腔粘连发生的绝对因素,其中人工流产占比最高,尤其稽留流产后清宫术、多次人工流产术。2.中重度宫腔粘连术后使用雌激素阴道给药修复内膜,能够有效改善子宫内膜厚度、子宫内膜血流灌注,增加月经量,一定程度地提高妊娠率,是中重度宫腔粘连分离术后促进内膜修复、防止复发的有效措施。第四部分雌激素阴道给药在薄型子宫内膜冻融胚胎移植周期中的临床应用[目的]回顾性分析雌激素阴道给药和口服给药在薄型子宫内膜冻融胚胎移植周期中的临床效果[方法]回顾性分析IVF/ICSI患者资料,将控制性促排卵周期HCG日子宫内膜厚度＜7mm取消移植、行FET激素替代治疗患者为研究对象。激素替代治疗方案口服给药组:自月经第3天口服雌二醇,4mg/d。阴道给药组:自月经第3天口服雌二醇,4mg/d,经净后减至雌二醇2mg/d,并添加阴道用雌二醇,1mg/d。给药10天后测量子宫内膜厚度如＜7mm,则延长给药时间,最长不超过20天。待内膜增长满意后,加孕酮转化内膜,于转化日测定血。在添加孕酮的第3/5天进行卵裂期/囊胚的复苏,次日行胚胎移植。术后14天测定血HCG;移植后28-30天超声检查确定临床妊娠;预产期后随访胎儿出生情况。统计分析患者一般情况及孕激素转化前使用雌激素的时间及剂量、E2水平、平均移植胚胎数、囊胚周期占比、临床妊娠率、活产率、产科并发症等。[结果]纳入符合条件的患者134例,其中口服给药组84例,阴道给药组50例,两组间一般资料无明显差异。阴道给药组的既往移植周期及既往取消周期次数明显多于口服给药组（P＜0.05）。用药后阴道给药组和口服给药组子宫内膜厚度均明显增厚,阴道给药组的子宫内膜增厚厚度高于口服给药组（P＜0.05）。内膜转化日的血E2水平阴道给药组明显高于口服给药组（P＜0.05）。阴道给药组HCG阳性率、临床妊娠率均高于口服给药组（P＜0.05）;两组的自然流产率、活产率均无明显差异（P＞0.05）。[结论]1.雌激素阴道给药能够增加难治性薄型子宫内膜患者的子宫内膜厚度,改善其妊娠结局。2.难治性薄型子宫内膜患者采用激素替代周期准备内膜时,雌激素阴道给药是一种可选择的、有效地促进内膜增长和改善妊娠结局的治疗方式。