论文部分内容阅读
酯酶(Esterase,EC3.1.1.1)是一类重要的生物催化剂,是指能够催化水解羧酸酯的所有酶的总称。塑化剂,是在塑料加工中添加的一种高分子助剂,其中柠檬酸酯类塑化剂是世界公认的环保型增塑剂。目前柠檬酸酯类塑化剂的生产都是通过化学合成完成的,鉴于酯酶具有水相分解,有机相催化合成的功效,因此探索酶法合成柠檬酸酯类塑化剂的途径,是绿色生物技术的研究方向之一。本研究以柠檬酸酯类塑化剂为唯一碳源,以添加溴甲酚紫指示剂的摇瓶的变色时间越短酯酶活性越高作为初筛依据,定向富集土壤样品,筛选出一株形态杆状,革兰氏染色阴性,无芽孢的细菌,经16S rDNA分子生物学测序分析,该菌株与嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的基因序列一致性达到99%,因此命名该菌株为嗜麦芽寡养单胞菌SF-H(Stenotrophomonas maltophilia SF-H,缩写为S.mal SF-H)。以SF-H菌株为出发菌株,经等离子诱变,获得了一株比对照菌酯酶活性高出20%的突变株S.mal SF-H1。对菌株S.mal SF-H1的发酵条件进行了优化,培养基成分为(L):麦芽糖30.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母粉2.5 g,(NH4)2SO4 4.0 g,KH2PO4 1.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,NaCl 0.5 g,Fe2+1.0 mg,Zn2+1.0 mg,Mn2+0.5 mg,Cu2+0.5 mg,无菌GF(1 mL/400 mL),诱导剂柠檬酸三丁酯(LM30)5.0 g,初始pH 7.0;在30℃,180 r/min,摇瓶培养30 h,菌株S.mal SF-H1酯酶活性达到最大。对菌株S.mal SF-H1产生的酯酶性质做了较详细的研究,结果表明:该酯酶对短链酯类的水解活性明显高于长链酯类,有明显底物特异性;以对硝基苯乙酸酯为底物时,酶液表现出良好的耐温性,最适温度为80℃,70℃保温2 h酶活性依然保存95%,最适pH 9.0,在pH 8.0稳定性最好,酯酶在体积分数在66%的丁醇和66%乙醇中,酶活损失较多,残留酶活约60%。鉴于菌株S.mal SF-H1酯酶具有较好的热稳定性,60℃真空旋转蒸发浓缩5倍,残存总酶活力是浓缩前总酶活力的97%以上,说明酯酶稳定性良好。为了增加酶的使用效率,也为将来在有机相应用酯酶催化合成,本研究首次选用沉淀吸附剂对酶浓缩液中的酯酶进行了固定化。结果表明可以将发酵液中的55.4%的酯酶充分固定,固定化酶30天内经多次催化反应后,依然可以保持85%的水解活性,为实际应用奠定了理论基础。