论文部分内容阅读
胰腺癌由于其起病隐匿、易转移、解剖位置复杂、手术困难和对放化疗不敏感等原因,已经成为主要的致死性癌症之一。寻找有效的基因治疗方法是改善胰腺癌预后的重要措施之一。有研究发现在植物中局部转染外源无启动子DNA可以引起整个系统的序列特异性基因沉默。但至今无人将其应用于人的细胞,特别是人的癌细胞。本实验从两方面验证了运用克隆有目的基因cDNA全长片段的重组质粒载体能够特异地抑制人胰腺癌细胞基因的表达。(1):利用绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein,GFP)的可视性,观察到整合入胰腺癌细胞系Panc-1的外源基因GFP被抑制;(2)观察到胰腺癌最常见的内源性癌基因K-ras在三种胰腺癌细胞系(Panc-1、Miapaca-2、Aspc-1)中被特异性抑制。1.构建3种重组质粒:含有GFP基因cDNA全长片段、含有K-ras基因cDNA全长片段与含K-ras基因cDNA第一外显子的片段(1)获取GFP基因cDNA全长片段:由pEGFP-C1质粒图谱信息得到GFP全长cDNA序列。设计特异引物并在引物两端加入酶切位点,扩增出GFP基因的cDNA全长片段。(2)获取K-ras cDNA全长片段:质粒pOPRSVI/MCS含K-ras cDNA全长。在其多克隆位点两侧选取不同的酶切位点进行酶切。(3)获取K-ras第一外显子DNA片段:提取含野生型K-ras基因的胰腺癌细胞系Bxpc-3的基因组DNA,在K-ras第一外显子两侧的内含子里设计引物(两端加入酶切位点)扩增含第一外显子的基因片段。(4)构建3种重组质粒:将上述基因片段分别连接到复制型质粒puc19。重组质粒分别命名为puc-GFP、puc-K-ras、puc-exon。3种重组质粒分别在DH5a大肠杆菌中进行转化、扩增并且采用琼脂糖电泳及测序鉴定正确序列。2.将外源基因GFP整合入人胰腺癌细胞系Panc-1将表达GFP的质粒pEGFP-C1转染入Panc-1细胞,并进行G418筛选。挑取具有抗新霉素抗性的克隆进一步培养,得到基因组内整合有EGFP基因的克隆细胞。倒置显微镜及流式细胞仪检测细胞克隆纯度。3.验证puc-GFP对GFP蛋白表达的抑制效应(1)流式细胞术及蛋白印迹技术证实puc-GFP可抑制整合入人胰腺癌细胞系Panc-1中的外源基因GFP的表达。抑制效应和转染的puc-GFP呈剂量、时间依赖性效应关系。(2)流式细胞术及倒置显微镜观察证实,puc-GFP可抑制GFP表达质粒pEGFP-C1在Panc-1细胞中的瞬时转染效率。抑制效应与puc-GFP与pEGFP-C1共转染细胞时的比值呈正相关。4.验证puc-K-ras及puc-exon对细胞内同源癌基因表达的抑制效果(1)实时定量RT-PCR检测mRNA的表达:puc-K-ras转染细胞系Panc-1后,分别在下面三种情况下收获细胞并提取其细胞的总RNA:a.不同剂量、同一时间;b.同一剂量,不同时间;c.挑取puc-K-ras稳定转染细胞系。将上述总RNA,经逆转录酶合成cDNA,最后在实时定量PCR扩增仪上进行扩增并分析结果。实验a、c设有未处理组、空质粒puc19组作为对照,实验b除设有上述两种对照组外还有K-ras siRNA组作为阳性对照;结果表明:a.puc-K-ras可抑制Panc-1细胞内源性癌基因K-ras的表达,并且抑制强度与转染质粒剂量呈正比;b.puc-K-ras瞬时转染Panc-1细胞后前两天其K-ras mRNA明显上升,第三天开始下降,直到转染后第十天K-ras mRNA水平仍明显低于正常对照组及空质粒组;c.puc-K-ras稳定转染细胞系的K-ras mRNA远远低于正常对照组和puc19稳定转染细胞系。(2)蛋白印迹检测蛋白表达:提取转染细胞及其各对照组细胞的总蛋白,经SDS-PAGE电泳及免疫杂交,结果表明:a.转染puc-K-ras的细胞K-ras蛋白明显下降。抑制效果与转染质粒呈剂量依赖关系;b.转染后第四天,K-ras蛋白开始下降,直到转染后第十天仍明显低于正常对照组和空质粒组;c.puc-K-ras稳定转染细胞系的K-ras蛋白远远低于正常对照组和puc19稳定转染细胞系。(3) puc-K-ras引起的基因抑制具有序列特异性:第一,在GFP表达已经被puc-GFP抑制的细胞中添加GFP表达质粒可使减弱的绿色荧光部分恢复;第二,puc-GFP可抑制整合入Panc-1细胞内的GFP基因表达,但不影响K-ras基因的表达;同样,puc-K-ras转染整合有GFP基因的Panc-1细胞,K-ras蛋白下降的同时不影响GFP的蛋白表达。(4)无启动子DNA片段引起的K-ras基因表达抑制与第一外显子的关系:为验证最常发生点突变的第一外显子是否是导致基因抑制的效应区,我们构建了含K-ras cDNA第一外显子DNA序列的质粒,并将其转染Panc-1细胞。蛋白印迹发现,只含第一外显子序列的DNA片段并不能引发序列特异性基因抑制。(5)无启动子DNA片段引起的K-ras基因抑制与点突变的关系:为观察此基因抑制与点突变的关系。Puc-K-ras分别转染另两种胰腺癌细胞系Miapaca-2和Aspc-1,它们含有与Panc-1相同或不同的K-ras点突变。蛋白印迹及实时定量RT-PCR(reverse transcriptive polymerase chain reaction)结果表明,在这两种细胞系中puc-K-ras具有与在Pane-1细胞内类似的抑制K-ras基因表达的效果。这说明无启动子DNA片段引起的特异性基因抑制与点突变无明显相关性。我们的研究表明无启动子的基因cDNA全长片段可在人胰腺癌细胞内引发序列特异的基因表达抑制,可能成为一种新的有效的基因治疗方法,但导致这种基因抑制的具体机制有待于进一步研究。另外,本实验结果提示无启动子DNA片段引起的序列特异性基因抑制可能与外源DNA片段中所含基因的cDNA片段长度相关,但与细胞内同源基因是否有点突变没有关系。本研究的创新点是首次证实了在植物中有效的同源无启动子DNA片段能使特异性基因沉默的方法,同样亦可用于抑制人类癌细胞特异性癌基因的表达。