塞内卡谷病毒（Seneca Valley Virus,SVV）属于小RNA病毒科塞内卡病毒属。2002年,偶然间在培养PER.C6细胞时发现了该病毒,首先命名为SVV-001。在肿瘤细胞中复制,作为溶瘤病毒被提议用于研究治疗具有神经内分泌特性的肿瘤。近年来,在美国、加拿大、巴西等很多国家都发现SVV与猪特发性水泡病（Porcine Idiopathic Vesicular Disease,PIVD）相关,感染猪临床表现为跛行,水泡并伴有精神沉郁、厌食,新生仔猪（<7天）病死率达到30-70%。细胞自噬是一个降解和循环长寿蛋白以及细胞器的细胞生理过程,也在饥饿和其他细胞压力下维持内稳态中扮有重要的作用。细胞自噬在抵御细胞内病原体复制过程中发挥重要的作用。细胞凋亡是在应对各种刺激时的一种依赖于能量的受基因控制的细胞自杀过程,在维持正常组织内稳态,清除衰老的、损伤的或感染的细胞中的作用至关重要。病毒感染会阻止细胞凋亡而利于病毒持续感染,也会促进细胞凋亡而利于病毒释放。本课题旨在探讨SVV感染与细胞自噬及细胞凋亡之间的作用关系,即揭示SVV诱发细胞自噬和细胞凋亡的分子机制以及二者对SVV复制的影响。1.SVV感染对细胞自噬和凋亡的影响为了评价SVV感染细胞后是否会引起细胞自噬和/或凋亡,将SVV感染293T细胞,在不同时间点收集样品,通过western blot检测细胞自噬和细胞凋亡相关蛋白的表达变化来分析SVV对细胞自噬和凋亡的影响。Western blot结果显示SVV感染后会促进LC3-I向LC3-II的转化,随着感染时间的延长和病毒感染复数的增加,LC3-I向LC3-II的转化程度增加;病毒感染6 h后p62蛋白发生降解,这些结果表明SVV感染可以诱导细胞自噬。细胞发生凋亡时,各种caspase蛋白被激活进而引起底物PARP1的切割,通过对病毒感染后PARP1蛋白表达检测结果显示,SVV感染9 h后能有效地切割PARP1;同时利用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测,结果显示SVV感染9 h时通过荧光显微镜可以观察到大量的绿色荧光,这些结果表明SVV感染可以诱导细胞凋亡。2.细胞自噬和凋亡对SVV增殖的影响SVV感染能有效地诱导细胞发生自噬,为了研究细胞自噬对SVV的影响,从诱导细胞自噬和抑制细胞自噬两方面来探讨。首先利用100 n M的Rapamycin处理细胞,2 h后用0.1 MOI的SVV感染,western blot检测结果显示SVV的增殖受到抑制。细胞自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后,SVV的增殖在病毒蛋白水平和子代病毒水平上都表现为促进作用。这些结果显示SVV感染细胞诱导的细胞自噬不利于病毒自身的复制。同样,为了评价SVV诱导细胞凋亡对其复制的影响,用不同浓度的泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理细胞,2 h后进行SVV感染,结果显示细胞凋亡受到抑制时,SVV VP1蛋白表达水平下降,病毒滴度也明显下降。结果表明SVV感染诱导的细胞凋亡有利于病毒的增殖。3.SVV 3C蛋白诱导细胞自噬和凋亡为了探讨SVV感染诱导细胞自噬和凋亡的分子机制,将紫外线灭活病毒接种细胞,结果显示灭活病毒不能诱导细胞自噬和凋亡,可知SVV诱导细胞自噬和凋亡依赖于病毒的复制过程。分别表达SVV的结构蛋白和非结构蛋白,观察病毒蛋白对细胞自噬和凋亡的影响,结果显示过表达3C能诱导细胞发生自噬和凋亡。小RNA病毒科病毒的3C蛋白是一种胰凝乳蛋白酶,在病毒的复制和致病中发挥重要作用。SVV 3C蛋白的48位组氨酸（H48）和160位半胱氨酸（C160）是两个重要的酶活性位点,构建两个单点突变体H49A和C161A,以及两个位点都突变的双位点突变体DM,结果显示酶活性位点突变后,3C蛋白削弱或完全失去了诱导细胞发生自噬和凋亡的能力,表明3C蛋白依赖于其蛋白酶活性诱导细胞自噬和凋亡。总之,本课题发现SVV感染能诱导发生细胞自噬和凋亡,其中细胞自噬不利于病毒的增殖,而细胞凋亡却对病毒有利;初步发现SVV的3C蛋白依赖于自身的蛋白酶活性诱导细胞自噬和凋亡。这些研究为SVV的感染及其致病机制研究提供一定的实验数据。