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圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）可在胞内积累油脂、类胡萝卜素等,具有工业化应用潜力。为改善其生产性状及研究相关分子机制,需要建立有效的遗传操作系统。目前已获得了R.toruloides的多组学信息,并建立了基于农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）的方法。然而,在 R.toruloides中非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）机制占主导,难以利用成熟的同源重组（Homologous recombination,HR）技术进行靶基因敲除,而基于ATMT技术只能随机整合外源基因,并且仍存在流程长、筛选标记有限等突出问题。针对上述问题,在R.toruloides中建立基于重组机制的遗传操作方法:探索通过农杆菌介导同源重组来进行靶基因敲除;建立位点特异性重组系统来进行多基因整合。主要研究内容及成果如下:1)ATMT介导同源重组敲除靶基因。选择八氢番茄红素脱氢酶基因CRTI作为靶基因,设计并构建带有CRTI同源臂的潮霉素（HYG）表达盒敲除载体pZPK-CRT-H,以R.toruloides的单倍体NP11为出发菌株,采用ATMT技术进行染色体整合,构建CRTI基因敲除菌NP11-ACRT.结果显示,约2%的转化子呈白色表型,不能合成类胡萝卜素,并且在其基因组DNA样品中未检测到完整的CRTI基因。分别构建强启动子PGPD和PADH2控制CRTI表达的载体pZPK-CRT-1和pZPK-CRT-2对NP11-△CRT进行基因回补,转化后产生了具有类胡萝卜素合成能力的红色转化子,回补菌株胞内类胡萝卜素含量为309 μg/g,与出发菌株NP11相比提高了 30%.上述研究表明,在R.toruloides中基于同源重组的基因打靶效率极低,明确了 CRTI的功能,并为改造R.toruloides提供了一个新的筛选标记基因。2)构建基于Cre/loxP技术的位点特异性重组系统。构建三种类型的HYG和博来霉素（BLE）双抗性双表达盒载体进行载体功能验证,其中正向连接的双表达盒载体pZPK-H-BLE-2通过ATMT技术验证了载体的功能;用重组酶基因替换pZPK-H-BLE-2上的BLE,构建重组酶表达载体（pZPK-H-GPD-CRE,pZPK-H-GPD-CREP）及带有BLE表达盒的重组位点载体（pZPK-Loxp-B）.其中重组酶基因Crep从pSH65上扩增而来,而Cre为根据R.toruloides密码子偏好性重新设计并合成的重组酶基因。将重组位点和重组酶载体依次转化至NP11中,发现表达Cre的转化子不能在含有博来霉素的平板上生长,该表型符合loxP重组位点间BLE抗性基因被删除的预期结果。上述结果表明,在R.toruloides中,成功建立了基于Cre/loxP技术的基因重组操作方法。3)构建并完善基于FLP/FRT技术的位点特异性重组系统。分别构建重组酶载体pZPK-H-GPD-FLP及重组位点载体pZPK-FRT-B,依次转化至NP11中,未能获得FRT重组位点间抗性基因被删除的表型。分析挖掘R.toruloides核定位序列信息,提出融合表达重组酶FLP和转录因子RHTO01582的核定位信号序列NLS3的思路,构建内源核定位信号融合重组酶表达载体pZPK-GPD-FLP-NLS3,再通过农杆菌介导转化至整合了重组位点表达盒的R.toruloides工程菌NP11-FRT-B中,成功获得了表型符合FRT重组位点间抗性基因删除的转化子,从而初步建立了基于FLP/FRT的重组方法。为精确控制FLP的表达,分别构建了抗生素自敲除载体pZPK-FRT-NAT-ADH2-FLP-NLS3及诱导型表达的FLP工程菌NP11-H-ADH2-FLP-NLS3,使FLP在缺乏葡萄糖的培养基中被诱导表达,能够通过重组来删除抗性基因。在R.toruloides中建立并完善了基于FLP/FRT技术的基因重组系统,为更复杂的基因操作奠定了基础。4)FLP/FRT重组酶系统的应用。构建带有重组位点的功能基因双表达盒载体pZPK-FRT-NAT/BLE-gene,转化至工程菌 NP11-H-ADH2-FLP-NLS3 中,通过 FLP 的诱导表达,删除了抗生素标记基因,建立了标记基因循环使用的方法。将甲醇利用途径4个关键基因（MDH,HPS,PHI,PTA）,依次整合到R.toruloides染色体上,获得了染色体整合表达五个外源基因的R.toruloides工程菌。将来源于三孢布拉霉（Blakeslea trispora）的类胡萝卜素合成相关基因（CarB,CarRP）整合至CRTI基因缺失菌株NP11-△CRT中,工程菌株重新获得了类胡萝卜素合成能力。为考察FLP/FRT技术在其它红酵母中应用的可行性,基于ATMT将FLP/FRT系统表达元件分别整合至海洋红酵母（Rhodotorula mucilaginosa,CGMCC 2.1515）和红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides,CGMCC 2.1609）中,获得了染色体整合外源基因的工程菌,但尚未见预期的位点特异性基因敲除功能。上述研究中所建立的FLP/FRT重组系统,在R.toruloides中实现了抗生素标记基因循环使用及多基因整合,进一步表明FLP/FRT技术是理性设计和编辑R.toruloides基因组的重要工具。