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蜂毒溶血肽(meIntin)具有杀菌、消炎等作用，但也具有溶解红细胞作用，这极大的限制了其在医药和临床方面的应用，且目前尚未弄清其溶血机理。本实验旨在利用基因工程表达蜂毒溶血肽，为其作为药物生产提供一条有效的途径；同时初步探明其溶血机理，为今后深入研究低毒高效的蜂毒溶血肽奠定基础。主要内容和结果如下：
1．分子结构的设计。检索GenBank得到蜂毒溶血肽氨基酸序列，根据酵母遗传密码子偏爱性，考虑其全基因中G、C、A、T含量的平衡，借助I)Nhsis软件，设计出蜂毒溶血肽序列。
2．基因的合成。合成末端互补带有双酶切位点的三条寡核苷酸片段JMl、JM2和JM3，以重叠区为引物，分别以JMl+JM2、JMl+JM3为模板，通过PCR获得两条全基因。
3．蜂毒溶血肽基因在Pichiapastorfs中的表达。构建pPICZa—A—mel载体，电击法转化酵母菌GS115，经PCR确认阳性克隆，用删／MD筛选Mut+型菌株，甲醇诱导，上清液经Tricine—SDS-PAGE电泳证实蜂毒溶血肽基因已整合到酵母基因组上，且表达产物具有溶血和抑菌活性。
4．一步法诱导表达的条件优化。单因素实验确定了重组酵母诱导培养基最佳甘油含量为2％。在此基础上设计培养基的洲值、重组酵母菌培养时间、甲醇诱导量、诱导时间和培养温度作为正交因子，以重组蛋白对鸡血红细胞的溶血效果为指标，对宿主菌表达外源蛋白的条件进行正交实验，得到了在实验室条件下表达的最适培养条件分别为pH为8，诱导温度为28℃，培养时间为48小时，甲醇量为1.O％，诱导时间为60小时。
5．表达产物的生物活性鉴定。抑菌和溶血活性实验表明两种表达产物均有很好的活性。实验表明，在甲醇酵母中重组蜂毒溶血肽I和Ⅱ的表达量分别为134．5μg／mL和280．5μg／mL。两种表达产物对K12D31的MIC分别是：16．80pg／mL和14．03μg／mL。
6．蜂毒溶血肽溶血作用机理的细胞形态水平研究。溶血实验表明，当天然蜂毒溶血肽浓度在1μg／mL时即发生溶血，浓度达到7μg／mL时完全溶血；环境扫描电子显微镜观察到蜂毒溶血肽作用后的红细胞膜干瘪、表面褶皱、变形，细胞变形性降低，菌体表面粗糙甚至破损；透射电镜下观察到红细胞胞质缩小，但核区无明显变化；激光共聚焦显微镜动态观察到蜂毒溶血肽分子大量聚集在红细胞膜表面，继而迅速瓦解红细胞。
7．蜂毒溶血肽与DNA相互作用。实验发现，蜂毒溶血肽并不直接与DNA发生任何形式的作用，推测蜂毒溶血肽只是通过与红细胞膜相互作用而达到溶血。
8．蜂毒溶血肽溶血作用对红细胞膜蛋白影响的研究。SDS—PAGE分析蜂毒溶血肽作用前后膜蛋白的变化发现，它与血红细胞作用的靶位点之一是膜蛋白。作用后的血红细胞膜蛋白组分发生了一定的变化，其中带2．1蛋白和带3蛋白被降解，在带4蛋白的几个亚型间产生了两条新带，根据分子量推断这两个条带为带3蛋白分解成的两个片段。