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目的:研究Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗和Ag85A DNA疫苗单独或联合化疗对小鼠药物敏感或耐多药结核病的治疗效果,为建立结核病尤其是耐多药结核病的免疫治疗新策略和新方案奠定基础。方法:1.采用分枝杆菌传统药物敏感试验和分子药敏试验方法筛选、鉴定结核分枝杆菌(M. tb)耐利福平(RFP)和异烟肼(INH)的临床分离株。2.结核分枝杆菌Ag85A/ESAT6嵌合DNA单独或联合化疗治疗小鼠结核病。采用菌量为2.5×106 CFU利福平和异烟肼敏感的M. tb HB240-1菌悬液经尾静脉感染80只雌性BALB/c小鼠,感染后第3天将小鼠随机分为下列8组进行治疗:(1)生理盐水组;(2)pVAX1载体组;(3)RFP组;(4)Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP组;(5)RFP和INH组;(6)Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP和INH组;(7)Ag85A/ESAT6 DNA组;(8)HSP65 DNA组。每只小鼠肌肉注射DNA 100μg/100μl,1次/10天,共注射5次。治疗结束后2周对小鼠肺、脾组织荷菌量、重量指数(WI)、大体病理等指标进行观察,了解DNA疫苗单独或联合化疗治疗药物敏感结核病的免疫治疗作用。3.结核分枝杆菌Ag85A DNA、Ag85A/ESAT6 DNA单独或联合利福平治疗小鼠耐多药结核病。采用菌量为2.2×105CFU耐RFP和INH的M. tb分离株HB361菌悬液经尾静脉感染90只小鼠,感染后第3天将小鼠随机分为下列9组进行治疗:(1)生理盐水组(;2)pVAX1载体组;(3)RFP组(;4)微卡菌苗组(;5)Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP组;(6)Ag85A/ESAT6 DNA组;(7)Ag85A DNA联合RFP组;(8)Ag85A DNA组;(9)HSP65 DNA组。每只小鼠肌肉注射100μg/100μl DNA,1次/15天,共注射5次。治疗结束后4周对小鼠肺、脾组织荷菌量、WI、大体病理和组织病理等指标进行观察,了解DNA疫苗单独或联合RFP治疗耐多药结核病的免疫治疗作用。4.结核分枝杆菌Ag85A DNA单独或联合RFP或吡嗪酰胺(PZA)治疗小鼠耐多药结核病。采用菌量为2.2×105CFU耐RFP和INH的M. tb分离株HB361菌悬液经尾静脉感染70只小鼠,感染后第2天将小鼠随机分为下列7组进行治疗:(1)pVAX1载体组;(2)RFP组;(3)PZA组;(4)微卡菌苗组;(5)Ag85A DNA组;(6)Ag85A DNA联合RFP组;(7)Ag85A DNA联合PZA组。每只小鼠肌肉注射100μg/100μl DNA,1次/15天,共注射5次。治疗结束后4周对小鼠肺、脾组织荷菌量、WI和组织病理等指标进行观察,了解DNA疫苗单独或联合RFP或PZA治疗耐多药结核病的免疫治疗作用。结果:1.从M. tb临床分离株中筛选、鉴定了3株耐RFP和INH的分离株HB240、HB361和HB401。2.与生理盐水组比较,RFP、Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP、RFP和INH、Ag85A/ESAT6 DNA联合REP和INH组肺菌落计数分别减少了1.82、0.86、1.87和1.88 logs,脾菌落计数分别减少了1.75、1.38、1.84和1.54 logs(p<0.01);肺、脾WI也显著降低(p<0.05);肺脏病变范围小、病变程度轻。3.与生理盐水和RFP组比较,微卡菌苗、Ag85A/ESAT6 DNA联合RFP、Ag85A/ESAT6 DNA、Ag85A DNA联合RFP、Ag85A DNA和HSP65 DNA组肺菌落计数分别减少了0.32、0.28、0.34、0.66、0.50和0.26 logs,脾脏菌落计数分别减少了0.29、0.31、0.37、0.68、0.46和0.28 logs(p<0.05,p<0.01)。肺大体病理和组织病理显示,各疫苗组肺病变均有不同程度减轻,病变局限,可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰。4. pVAX1载体、RFP和微卡组小鼠死亡率均为10%,其余各组小鼠均存活。与pVAX1载体和RFP组比较,PZA、微卡菌苗、Ag85A DNA、Ag85A DNA联合RFP、Ag85A DNA联合PZA组肺脏菌落数分别减少了0.91、0.93、1.32、1.25和0.87 logs;脾脏菌落数分别减少了0.67、0.72、0.97、1.21和0.75 logs(p<0.01)。肺组织病理显示,各治疗组肺脏病变均有不同程度减轻,病变局限,可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰。结论:1.分别应用菌量为2.5×106 CFU的RFP和INH敏感株HB240-1和菌量为2.2×105 CFU耐多药株HB361建立了小鼠药物敏感和耐多药结核病模型。2.结核分枝杆菌Ag85A/ESAT6嵌合DNA联合化疗治疗小鼠药物敏感结核病的疗效明显强于Ag85A/ESAT6嵌合DNA单独应用。3.结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗单独应用或联合利福平治疗小鼠耐多药结核病的疗效明显强于Ag85A/ESAT6嵌合DNA、HSP65 DNA和微卡菌苗。4.结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗单独应用或联合RFP治疗小鼠耐多药结核病的疗效优于微卡菌苗、PZA以及与PZA联合。Ag85A DNA疫苗与抗结核药物联合治疗是治疗耐多药结核病的最有前途的免疫策略。