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目的：弓形虫病是一种在世界范围内广泛流行的人兽共患病寄生虫病,可以造成孕妇流产和胎儿畸型,并且是引起免疫功能缺陷患者死亡的重要病原体之一。现有的抗弓形虫药物都存在副作用大、停药后易复发等不足,目前临床仍缺乏有效的治疗药物。顶质体缺乏引起的“迟发型死亡”为弓形虫病治疗提供了一条新途径,但其确切机制仍不完全清楚,难以应用于临床治疗。因此,开展“迟发型死亡”机制研究对弓形虫病的防治具有重要意义。方法：收集体外培养的弓形虫RH株速殖子并提取其RNA,RT-PCR法分别扩增酰基载体蛋白(ACP)和p-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)编码基因,构建原核表达载体acp/pET28和fabz/pET32,并在大肠杆菌rostta株表达。重组ACP和FABZ蛋白经Ni-NTA亲合纯化柱纯化,并免疫家兔制备多克隆抗体。以兔多克隆抗体Western blotting法检测虫体ACP和FABZ表达。收集体外培养的弓形虫hxgprt株速殖子并提取其DNA, PCR法扩增ACP蛋白基因,构建弓形虫转染载体pHX-ACP-GFP,电穿孔法导入hxgprt株速殖子,霉酚酸和黄嘌呤筛选ACP-GFP突变株。激光共聚焦显微镜观察ACP-GFP融合蛋白在虫体的分布,以兔抗GFP多克隆抗体Western blotting法检测ACP-GFP蛋白的表达。人包皮成纤维(HFF)细胞中接种弓形虫ACP-GFP突变株5×105个,24 h后在培养液中添加终浓度1mM克林霉素诱导“迟发型死亡”,于2 h、4h和6h收集虫体。Real-time PCR法检测虫体ACP和GRA1蛋白编码mRNA表达,Western blotting法检测ACP和GRA1蛋白表达,激光共聚焦显微镜观察ACP-GFP融合蛋白在虫体内分布。收集体外培养TATi株速殖子并提取DNA, PCR法扩增FABZ蛋白基因,构建含有Ty标签的可诱导敲除载体pTetO7-Sagl-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入TATi株,1μg/ml乙胺嘧啶筛选可诱导敲除突变株,以Ty单克隆抗体Western blotting法检测突变株FABZ-Ty融合蛋白表达。将该突变株接种HFF细胞,加入1μg/ml脱水四环素(ATc)启动可诱导敲除系统,于24 h和48 h时收集虫体,Western blotting法检测虫体FABZ-Ty融合蛋白表达量。HFF细胞中接种四环素可诱导敲除突变株5×105个,同时加入1μg/mlATc启动可诱导敲除系统。分别于感染后2h、4h、8h、12 h、24h和48h收集虫体,Real-time PCR法检测不同时间FABZ蛋白编码mRNA表达量以及虫体uprt基因拷贝数,Giemsa染色法观察不同时间HFF细胞内速殖子/纳虫泡数量。结果：弓形虫cDNA中分别扩增出约550 bp和700 bp的ACP和FABZ蛋白编码基因。PCR、限制性内切酶酶切和基因测序鉴定结果表明载体acp/pET28和fabz/pET32构建成功。转化大肠杆菌rostta株并成功表达重组ACP和FABZ蛋白,经Ni-NTA亲合纯化柱纯化获得纯度较高的重组蛋白。制备的多克隆抗体可以分别检测出虫体ACP和FABZ蛋白的转运肽型及成熟型。弓形虫基因组DNA中扩增出约1300 bp的acp基因。PCR、限制性内切酶酶切和基因测序鉴定结果表明载体pHX-ACP-GFP构建成功,可以用于虫体转染。虫体经1次电击后仍有大量存活并可迅速进入HeLa细胞,霉酚酸和黄嘌呤2～3天即可杀死未转染虫体。激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光呈点状聚集于顶质体,部分绿色荧光弥散地分布于虫体内质网。兔抗GFP多克隆抗体Western blotting法可以识别出虫体ACP蛋白的转运肽型(t-ACP)和成熟型(m-ACP)。1μM克林霉素作用2h和4h,虫体ACP蛋白编码mRNA表达量较对照组无显著性差异；作用6 h,ACP蛋白编码mRNA表达量较对照组显著降低。Western blotting结果表明,克林霉素作用2 h,虫体t-ACP和m-ACP表达量与对照组无明显差异；作用4h,虫体m-ACP表达量较对照组显著降低,而t-ACP表达量无明显变化；作用6h后,虫体t-ACP和m-ACP表达量均明显降低。激光共聚焦显微镜观察到克林霉素作用2h,虫体内同时存在着点状绿色荧光和弥散成片的绿色荧光；作用4 h,点状绿色荧光逐渐减少,弥散的绿色荧光变化不明显；作用6 h,点状绿色荧光基本消失,弥散的绿色荧光较2h和4h明显减弱。TATi株虫体基因组DNA中扩增出约800 bp产物。PCR法、限制性内切酶酶切法和基因测序法鉴定pTetO7-Sag 1-FABZ-Ty-DHFR载体构建成功。1μg/ml乙胺嘧啶2-3天即可杀死未转染虫体。Ty标签单克隆抗体Western blotting法检测出虫体转运肽型和成熟型FABZ-Ty融合蛋白。1μg/ml ATc启动四环素可诱导敲除系统,24 h和48 h均检测出成熟型FABZ-Ty融合蛋白表达量较对照组显著降低。ATc作用4 h,虫体FABZ蛋白编码mRNA表达量较对照组降低；随时间延长,ATc组虫体FABZ蛋白编码mRNA表达量进一步减少,48 hFABZ蛋白编码mRNA已降至极低水平。Giemsa染色法观察,2 h、4 h和8 h ATc组和对照组HFF细胞内速殖子数量未见明显差异；12h可见ATc组纳虫泡数量少于对照组,24 h对照组可见少量游离虫体,但ATc组仅见纳虫泡数量增多。48 h对照组HFF细胞内出现大量纳虫泡且部分细胞已被虫体涨破,而ATc组仅见纳虫泡数量增多。ATc作用2h和4 h,Real-time PCR法检出ATc组和对照组虫体uprt基因拷贝数无显著性差异；8h和12h,ATc组虫体uprt基因拷贝数开始低于对照组,但无统计学差异；24h和48h,ATc组虫体uprt基因拷贝数明显低于对照组。结论：通过原核表达弓形虫重组ACP和FABZ蛋白并制备其多克隆抗体,可以检测出虫体ACP和FABZ的转运肽和成熟型,为顶质体蛋白转运机制研究奠定了基础。ACP蛋白可用于标记顶质体以及研究核基因组编码的顶质体蛋白的转运方式。HXGPRT是一种较为理想的弓形虫突变株筛选标记,可以快速筛选出稳定的弓形虫突变株。通过突变株所带附加标签,可以方便地检测所需研究的蛋白,省去了制备多克隆抗体的繁琐。克林霉素未直接影响弓形虫核基因编码的顶质体蛋白的转录翻译,而是通过抑制顶质体增殖,使虫体内顶质体数量明显减少,顶质体蛋白无法经顶质体加工变为成熟蛋白发挥生物学功能,导致顶质体相关代谢功能的丧失,并最终引起虫体死亡。四环素可诱导敲除系统可以用于弓形虫重要基因功能的研究,避免了敲除虫体重要基因引起的虫体死亡。1μg/ml ATc即可启动该系统并获显著的抑制效果。以四环素可诱导敲除系统抑制弓形虫FABZ蛋白编码基因表达,缺乏FABZ蛋白的虫体仍能持续增殖一定时间,其现象与“迟发型死亡”一致,表明FASⅡ代谢障碍可能是引起“迟发型死亡”的原因。