论文部分内容阅读
目的：体外培养人脐静脉内皮细胞，探索人参皂苷Rb3对ox-LDL所致内皮细胞损伤的保护机制，为具有益气养阴作用的西洋参茎叶总皂苷的临床应用提供实验依据。方法：取健康产妇分娩的新生儿脐带，用0.1%胶原酶Ⅰ消化取脐静脉内皮细胞；分别应用含20%FBS、10ng/ml EGF的DMEM培养液和含8%FBS、2%LSGS的M199培养液培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），观察其生长情况；0.25%猪胰蛋白酶溶液消化细胞传代培养；Ⅷ因子相关抗原间接免疫染色方法对细胞进行鉴定。以体外培养的HUVECs为研究对象，建立ox-LDL刺激内皮细胞损伤模型。实验共分为8个组：正常对照组（NOR）、模型组（MOD）、雌二醇组（E2，0.01μM）、雌二醇+雌激素受体抑制剂ICI182780组（E2I，E2：0.01μM，ICI：1μM）、人参皂苷Rb3低剂量组（RL，1μM）、人参皂苷Rb3中剂量组（RM，10μM）、人参皂苷Rb3高剂量组（RH，100μM）、人参皂苷Rb3中剂量组+雌激素受体抑制剂ICI182780组（RMI，RM：10μM，ICI：1μM），各给药组，在ox-LDL刺激前，药物预处理1小时，加予ICI182780组，在药物处理前1h给予ICI182780，然后共同作用24h后进行检测。取细胞培养上清液检测NO、ET-1、sE-selectins、sICAM-1含量，取细胞裂解液检测胞内NOS、SOD、MDA水平，提取细胞总RNA应用RT-PCR检测iNOS和eNOS基因表达水平，收集细胞采用流式细胞仪结合AnnexinV-FITC/PI双染色法测定HUVECs凋亡率，Western blot法检测细胞Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白水平。结果：①0.1%胶原酶Ⅰ消化脐静脉所得原代内皮细胞在接种后约4h开始贴壁生长，光镜下贴壁生长的内皮细胞可汇合成典型的铺路石状，用含8%FBS、2%LSGS的M199培养液培养的内皮细胞可稳定传代至6～7代。Ⅷ因子相关抗原间接免疫染色法鉴定可见细胞胞质中有棕黄色颗粒，即所培养细胞表达Ⅷ因子相关抗原，为内皮细胞。②氧化损伤的检测：与NOR相比，MOD组HUVECs SOD活力明显降低（P0.01），MDA含量明显增多（P0.01）；与MOD组比较，E2、RL、RM、RH组HUVECs SOD活力明显升高（P0.01或P0.05），MDA含量明显降低（P0.01）；运用ICI182780预处理后，与对应药物组相比， HUVECs SOD活力明显降低（P0.05），MDA合成明显增多（P0.01）。③致炎因子的检测：与NOR相比，MOD组HUVECs sE-selectin、sICAM-1含量均明显增多（P0.01）；与MOD组比较，E2、RM、RH组HUVECs sE-selectin含量均明显降低（P0.01），RL组无统计学差异；与MOD组比较，E2、RL、RM、RH组HUVECssICAM-1含量均明显降低（P0.01）；运用ICI182780预处理后，与对应药物组相比，HUVECs sE-selectin、sICAM-1含量均明显增多（P0.01）；另外，与RL组相比，RH组HUVECs sICAM-1含量进一步降低（P0.05）。④内皮细胞功能的检测：与NOR相比，MOD组HUVECs NOS、NO、ET-1含量及iNOSmRNA表达均显著升高（P0.01），eNOS mRNA表达显著降低（P<0.01）；与MOD组比较，E2、RL、RM、RH组HUVECs NOS、NO、ET-1含量及iNOS mRNA表达均明显降低（P0.01），eNOS mRNA表达显著升高（P<0.01）；运用ICI182780预处理后，与对应药物组相比，HUVECs NOS、NO、ET-1含量及iNOS mRNA表达均显著升高（P0.01或P0.05），eNOS mRNA表达显著降低（P0.01或P0.05）。⑤细胞凋亡的检测：与NOR相比，MOD组HUVECs早期凋亡细胞(Annexin V阳性/PI阴性)及晚期凋亡和坏死细胞(AnnexinV阳性/PI阳性)比率明显增加(P<0.01)；与MOD组比较，E2、RL、RM、RH组HUVECs早期凋亡细胞比率明显降低(P<0.01)，E2、RM、RH组HUVECs晚期凋亡和坏死细胞比率明显降低(P<0.01)，RL组无统计学差异；运用ICI182780预处理后，与对应药物组相比，HUVECs早期凋亡细胞及晚期凋亡和坏死细胞比率增加(P<0.01)。⑥雌激素相关信号通路蛋白的检测：与NOR组相比，MOD组HUVECs细胞p-Akt、p-ERK1/2蛋白表达明显增高（P0.01），p-p38MAPK蛋白表达明显降低（P0.01）；与MOD组比较，E2、RH、RM组HUVECs细胞p-Akt蛋白表达均明显减少（P0.05），RL组HUVECs细胞p-Akt蛋白表达也呈降低趋势，但无统计学意义；与MOD组比较，E2、RH组HUVECs细胞p-ERK1/2蛋白表达均明显减少（P0.01），RM、RL组HUVECs细胞p-ERK1/2蛋白表达无统计学差异；与MOD组比较，E2、RH、RM、RL组HUVECs细胞p-p38MAPK蛋白表达均明显增高（P0.01）；运用ICI182780预处理后，与对应药物组相比，HUVECs细胞p-Akt、p-ERK1/2蛋白表达明显增高（P0.01或P0.05），且E2I组细胞p-p38MAPK蛋白表达明显降低(P0.05)；但与RM组相比，RMI组HUVECs细胞p-p38MAPK蛋白表达无统计学差异。结论：①成功分离培养人脐静脉内皮细胞，为体外研究血管内皮细胞损伤及药物保护机制提供保障。②人参皂苷Rb3可通过与雌激素受体结合实现抑制内皮细胞氧化应激、炎症反应激活、ET-1和NO过度释放、细胞凋亡及降低Akt、ERK1/2蛋白磷酸化水平等类雌激素样血管保护作用，其作用效应较雌激素弱。③人参皂苷Rb3可通过影响p38MAPK介导内皮细胞保护作用，说明人参皂苷Rb3还可通过其它途径发挥血管内皮细胞保护作用。④气阴两虚是雌激素下降的主要病机，益气养阴有一定雌激素效应。