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研究背景:脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)会导致运动和感觉功能完全丧失。尽管脊髓外科手术技术在不断进步,但对于这种棘手的神经系统损害仍然缺少有效的治疗方法。因此,进一步研究SCI的分子机制是非常重要的。在本研究中,我们采用RNA测序技术(RNA-Seq)对大鼠SCI后不同阶段的全基因组转录谱进行分析,以系统地鉴定SCI病理过程中的关键基因和信号通路。目的:1.阐明大鼠SCI局部基因转录水平表达的变化规律;2.筛选、鉴定出SCI病理过程中的关键分子和信号通路。方法:(1)采用纽约大学SCI仪制备重物坠落SCI大鼠模型;(2)采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动功能评分观察各实验组SCI大鼠运动情况;(3)采用RNA-Seq技术分析SCI不同阶段损伤局部基因在转录水平的表达变化;(4)选择具有显著变化的基因,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)进行验证;(5)对差异表达的基因进行Gene ontology(GO)和Kyoto encyclopedia of genesand genomes(KEGG)等生物信息学分析;(6)采用Western Blot在蛋白水平进行验证;(7)采用免疫组织荧光染色法对所选蛋白进行细胞定位。结果:RNA-Seq分析表明:与假手术组比较,急性损伤组(SCI-1d)共有1797个差异表达的基因,其中1223个上调和574个下调;亚急性损伤组(SCI-6d)总共有6590个差异表达的基因,其中3460个上调和3130个下调;慢性损伤组(SCI-28d)组共有3499个差异表达的基因,其中1866个上调和1633个下调(通过DESeq调整后p<0.05)。GO富集分析显示显著富集的基因主要为免疫反应、MHC蛋白复合物、抗原加工和递呈、翻译相关基因、核糖体的结构组成、离子通道活性、小GTPase介导的信号转导、细胞因子/趋化活性等。KEGG通路分析表明显著富集的途径包括核糖体、抗原加工和递呈、逆行内源性大麻素信号、轴突导向、多巴胺能神经突触、谷氨酸能突触、突触、TNF-α、HIF-1α、NF-κB、Toll样受体、NOD样受体、c AMP、钙、催产素、Rap1、B细胞受体和趋化因子信号通路。我们进一步选取两个高表达的分子Ncf1和Plau,在蛋白水平探讨它们在SCI后的表达规律和细胞定位。结果表明,SCI后二者表达均升高。Ncf1在亚急性期和慢性期高表达,而Plau整个损伤过程表达均升高。它们均分布于浸润的白细胞。结论:1.RNA-Seq分析表明:与假手术组比较,脊髓损伤大鼠损伤局部急性期有1797个差异基因;亚急性期有6590个差异基因;慢性期3499个差异基因。2.在脊髓损伤急性期,核糖体、TNF-α、蛋白多糖、疟疾和金黄色葡萄球菌感染等是富集的信号通路;亚急性期包括谷氨酸能突触、circadian entrainment、GABA能突触、逆行内源性大麻素信号等;慢性期有逆行内源性大麻素信号、催产素信号、Rap1信号、突触囊泡循环等。3.本实验在m RNA和蛋白水平进一步探讨了Ncf1和Plau在脊髓损伤后的表达和定位。结果证实脊髓损伤后二者表达均增加。Ncf1在亚急性期和慢性期高表达,而Plau在急性期、亚急性期和慢性期表达均升高。高表达的Ncf1和Plau均分布于浸润的白细胞,提示它们参与SCI的炎症过程。