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2,3-丁二醇(2,3-Butanediol,2,3-BD)及其前体 3-轻基丁酮(Acetoin,AC)都是重要平台化合物,广泛用于化工、食品等领域。2,3-丁二醇有两个手性碳原子而表现出三种构型((2R,3R)-、meso-和(2S,3S)-),3-经基丁酮有一个手性碳原子表现出两种构型((3R)-和(3S)-),均是具有潜在应用的药物中间体。本论文以粘质沙雷氏菌H30(S.marcescensH30)为出发菌株,通过分子生物学技术对乙偶姻及2,3-丁二醇的合成机制及生物法制备乙偶姻及2,3-丁二醇开展以下研究工作:1.S.marcescens H30中过表达2,3-丁二醇脱氢酶的研究针对S.marescens H30发酵生产2,3-BD过程中副产物AC大量积累现象,构建了能够在S.marcescens H30中过表达2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的载体pPbudK-BDH,并将该载体电转至S.marcescensH30,得到 S.marcescens H30-BDH工程菌。利用该工程菌在5 L发酵罐上进行分批发酵实验,实验结果显示,BDH的过表达可以将2,3-BD产量提高78.5%并将AC的积累量减少86.1%,与野生菌相比过表达菌的代谢副产物乙醇、乳酸和琥珀酸分别减少45.3%、27.2%和51.9%。此外,过表达菌中BDH的酶活性比野生菌中BDH的酶活性的高出21倍,进而导致NADH处于低水平池,NAD+处于高水平池。2.meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的克隆表达、催化特性及酶学性质研究为了验证BDH催化AC生成2,3-BD的能力及催化AC生成哪种构型的2,3-BD。利用pET28a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了 2,3-BDH的重组表达,并对重组酶进行了纯化。底物特异性测定显示重组酶能以meso-2,3-BD、(2S,3S)-2,3-BD、(3S/3R)-AC 和 DA 为底物,但无法催化(2R,3R)-2,3-BD。结合动力学测定结果表明BDH是一种NAD(H)依赖型meso-BDH。催化产物分析结果表明,在还原反应中,meso-BDH催化DA及(3R)-AC分别生成(3S)-AC和meso-2,3-BD,且当催化体系pH为9.0时,(3S)-AC会被进一步催化生成(2S,3S)-2,3-BD;在氧化反应中,meso-BDH 催化meso-2,3-BD 及(2S,3S)-2,3-BD分别生成(3R)-AC和(3S)-AC。此外,Fe2+可以提高meso-BDH在以meso-2,3-BD为底物进行氧化反应的酶活性;Mg2+和Mn2+可以提高meso-BDH在以DA或(3S/3R)-AC为底物进行还原反应的酶活性,而其他几种金属离子表现出抑制作用,尤其是Fe3+。3.甘油脱氢酶基因的克隆表达、催化特性及酶学性质研究实验室在研究沙雷氏菌时,发现在敲除其meso-BDH基因后,发酵过程中仍会有少量2,3-BD生成,暗示还存在其他类似的脱氢酶参与了 2,3-BD的合成,为了进一步揭示S.marcescens H30中AC及2,3-BD的合成机制,利用pET28a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了甘油脱氢酶(GDH)的重组表达,并对重组酶进行了纯化。底物特异性测定显示重组酶能以DA、(3S/3R)-AC、meso-2,3-BD和(2R,3R)-2,3-BD为底物,但无法催化(2S,3S)-2,3-BD。体外催化实验表明,在还原反应中,GDH催化DA及(3R)-AC分别生成(3S)-AC和(2R,3R)-2,3-BD,其中(3S)-AC会被进一步催化生成meso-2,3-BD;在氧化反应中,GDH催化meso-2,3-BD 及(2R,3R)-2,3-BD 分别生成(3S)-AC 和(3R)-AC。此外,该酶在氧化还原反应中的最适温度为60℃,表现出了较高的耐热性。Fe2+可以显著提高GDH在以meso-2,3-BD为底物进行氧化反应的酶活性;Mn2+可以提高GDH在以(3S/3R)-AC为底物进行还原反应的酶活性,而其他金属离子对此催化反应表现出抑制作用,尤其是Fe2+和Fe3+。4.(3R)-乙偶姻工程菌的构建及发酵过程的优化在本实验室已克隆到来自S.marcescens H30的AC操纵子和来自Lactobacillus brevis的NADH氧化酶(nox)基因的基础上,在大肠杆菌DH5α中重构了含有budR、budA、budB及nox基因的AC代谢途径,手性柱气相色谱分析表明该工程菌主要生成(3R)-AC,手性纯度达97.3%。此外,单因素实验结合正交设计方法对发酵条件及培养基组成进行优化,在最佳优化条件下摇瓶发酵产(3R)-AC浓度为38.3 g/L。在5L发酵罐中进行发酵放大实验,当在最优转速下且进行脉冲式补料发酵时,(3R)-AC的最高产量达到60.3 g/L,(3R)-AC的产率为1.55g/L·h,底物转化率为86.3%。5.重组大肠杆菌全细胞催化双乙酰合成(3S)-乙偶姻在第二章成功构建E.coli BL21(DE)/PET28a-BDH的基础上,将该重组大肠杆菌用于全细胞催化合成(3S)-AC的研究中,探讨了温度、pH、细胞密度、辅助底物浓度、底物浓度在催化合成(3S)-AC中的影响,实验结果表明37℃为最佳温度,pH为8.0时得率最高。在此基础上,选择菌体湿重、葡萄糖浓度、双乙酰浓度进行正交试验,得到最佳催化组合为:10 mL催化体系中,双乙酰浓度:4.0 g/L,葡萄糖浓度:1.8 g/L,菌体湿重:40 g/L,催化时间:5 h。在此条件下催化合成的(3S)-AC纯度为98.11%,浓度为3.51 g/L,较未优化之前提高了 69.56%,双乙酰转化率可达:87.75%。