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苜蓿（Medicago sativa L.）是一种重要的豆科牧草，素有“牧草之王”之称。而盐碱胁迫严重地影响了苜蓿的生长效率、根瘤形成以及根瘤菌的固氮能力，从而限制了苜蓿的产量。松嫩平原西部地区是世界三大碱土集中分布区之一，面积高达373万hm2，在这样的土壤环境下，植物受着钠离子和碳酸氢根离子造成的离子毒害，及由高pH值造成的生理毒害作用。因此利用基因工程手段培育耐盐碱转基因苜蓿新品种，充分利用我国盐碱地资源，满足畜牧业对牧草产量日益增加的需要，具有重要的研究价值和广阔的开发应用前景。 谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一类在植物胁迫耐受及细胞解毒过程中起着重要作用的酶。本研究以耐盐碱野生大豆为试材，结合本实验室构建的野生大豆碱胁迫基因表达谱，以及基于表达谱构建的碱胁迫调控网络，筛选出3个GST家族的基因一一GsGST13、 GsGST14和GsGST19，并克隆得到其全长CDs。构建了3个由组成型启动子调控的植物表达载体，并应用农杆菌介导法对苜蓿进行了遗传转化，获得转基因苜蓿新株系。分析转基因植株的耐碱性及生长发育状况，发现这3个野生大豆GST基因均能提高转基因植物的耐碱能力。本文的主要研究结果如下： 1．野生大豆碱胁迫应答关键基因的筛选 根据本实验室构建的野生大豆碱胁迫转录谱，及基于该转录谱构建的野生大豆碱胁迫应答基因调控网络，筛选得到了3个GST家族的碱胁迫应答基因，分别命名为GsGST13、GsGST14和GsGST19，三个基因都位于碱胁迫基因调控网络的关键节点位置。 2．GsGST13、GsGST14和GsGST19全长基因的克隆及序列分析 利用反转录PCR扩增得到了3个野生大豆碱胁迫应答关键基因：GsGST13、GsGST14和GsGST19。通过对预测蛋白结构分析发现，GsGST13（编码219个氨基酸）、GsGST14（编码224个氨基酸）和GsGST19（编码225个氨基酸）均属于Tau类GST亚家族成员，都具有GST家族的特征性结构域，分别包含有相对保守的结合谷胱甘肽(GSH)的G-位点，以及相对多样性的结合疏水分子的H-位点。 3．GsGST13、GsGST14和GsGST19植物表达载体的构建 构建了3个由E12和CaMV35S启动子调控植物表达载体——pCBE-GsGST13、pCBE-GsGST14和pCBE-GsGST19，用于GsGST13、GsGST14和GsGST19基因在苜蓿中的整合表达及基因的功能分析。 4．转基因苜蓿的获得 应用根癌农杆菌介导法，将GsGST13，GsGST14，GsGST19基因转化紫花苜蓿栽培品种肇东苜蓿，并获得大量再生植株。通过PCR鉴定，共获得转GsGST13基因PCR阳性植株12株，转GsGST14基因PCR阳性植株11株，转GsGST19基因PCR阳性植株17株。随机从GsGST13、GsGST14和GsGST19转基因PCR阳性植株中各选取2个株系进行RT-PCR分析，结果显示GsGST13、GsGST14和GsGST19在转基因苜蓿中均得到了超量表达。 5．转基因苜蓿耐碱性分析 通过对GsGST13、GsGST14和GsGST19转基因苜蓿扦插幼苗在0、50、1OOmmol/L NaHCO3胁迫处理条件下的生物学分析，发现GsGST13、GsGST14和GsGST19转基因苜蓿均具有较高的GST酶活性，并且在碱胁迫条件下能够促进GST酶和SOD酶活性的诱导，减小碱胁迫对植物产生的氧化伤害，并且通过降低碱胁迫对转基因植物细胞膜的氧化损伤，保护细胞膜的完整性，从而使转基因植物在碱胁迫条件下保持较高的叶绿素含量和根系活力，确保转基因植物在碱胁迫条件下仍然保持较高的光合能力和根系吸收能力，使转基因植物具有较强耐碱能力。