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第一章 马尔尼菲青霉菌对树鼩感染性的实验观察目的 建立树鼩马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM)经呼吸道感染的动物模型,观察PM感染树鼩的组织病理学改变,探讨PM的感染机制。方法 将20只成年、健康雄性云南滇西亚种树鼩(Tupaiabelangeri chinensis)随机分为5组(其中一组为对照组,4个感染组分别为感染2周、3周、4周、6周)。将25℃马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长7天的PM孢子,制成活菌悬液,调整孢子浓度为2×108/ml；每周经呼吸道滴入500ul孢子悬液感染各实验组树鼩,对照组树鼩不做任何处理。于指定时间处死树鼩,取部分肺组织进行真菌培养,部分肺、肝、脾、淋巴结组织经固定、脱水、包埋、切片后用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin, HE)及过碘酸雪夫(Periodic acid-Schiff, PAS)染色观察组织病理变化；收集肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)离心收集细胞沉淀,用瑞氏-吉姆萨染色后,在显微镜下进行白细胞分类计数,比较各组肺泡灌洗液白细胞总数、中性粒细胞数、淋巴细胞数、巨噬细胞数的差异。应用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。结果 实验组树鼩肺组织培养后均有PM生长,表现为25 ℃ PDA培养基上生长的黄色绒毛状菌落,并产生酒红色色素浸入培养基,棉兰染色后镜下表现为典型帚状枝结构及大量圆形、椭圆形分生孢子,符合典型PM特征,阳性率达到100%；树鼩组织病理学观察可见包括肺、脾、淋巴结的组织均可致病,肺组织病理改变表现为以细支气管为中心的化脓性炎症反应,大量炎症细胞浸润,局部有脓肿形成趋势,肺泡腔内巨噬细胞、中性粒细胞增多；实验组BALF细胞数明显高于对照组,感染2、3、4周树鼩BALF中细胞以中性粒细胞、淋巴细胞增多为主(P<0.05)；感染6周树鼩以淋巴细胞增多为主(P<0.05)。结论(1)感染PM的树鼩,肺部、脾脏和淋巴结出现明显的炎性改变；(2)PM感染后的树鼩,肺部炎症早期(4周内)以中性粒细胞增多为主,后期(4周后)炎症反应减轻,但淋巴细胞仍增高。第二章马尔尼菲青霉菌孢子对人支气管上皮细胞的粘附吞噬作用及对炎症因子IL-6、IL-8影响的实验观察目的探讨人支气管上皮细胞株BEAS-2B对PM孢子的粘附吞噬作用及PM孢子刺激人支气管上皮细胞的炎症因子IL-6、IL-8改变。方法将人支气管上皮细胞株BEAS-2B与PM孢子在有载玻片的6孔板上共培养6小时,经过多次洗涤后进行PAS染色,观察BEAS-2B细胞粘附PM孢子的情况；将PM孢子与BEAS-2B细胞共培养1.5小时,在透射电镜下观察BEAS-2B细胞吞噬PM孢子的过程；实验分为10个组(分别为空白组、LPS组、HIV阴性分离株组、HIV阴性分离株+LPS组、HIV阳性分离株组、HIV阳性分离株+LPS组、FRR2161组、FRR2161+LPS组、野生分离株组、野生分离株+LPS组),将刺激物与BEAS-2B细胞共培养24小时、48小时、72小时后,用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测细胞上清液的IL-6和IL-8变化。应用SPSS 16.0统计学软件完成统计学分析。结果PAS染色下BEAS-2B细胞与PM孢子共培养6小时后,PM孢子紧密粘附在细胞周围；共培养2h后,可观察到BEAS-2B细胞吞噬PM孢子现象,细胞内溶酶体增多,孢子细胞壁被破坏,细胞线粒体空泡化,部分出现轻度肿胀,随着培养时间的延长,细胞吞噬孢子增多,溶酶体明显增多,向吞噬泡聚集,孢子出现不同程度的破坏；HIV阴性分离株、HIV阳性分离株、FRR2161、野生分离株四株PM菌株都可引起细胞分泌IL-6及IL-8增多,HIV阴性分离株+LPS的刺激作用较HIV阳性分离组+LPS、FRR2161+LPS、野生分离株+LPS作用弱(P<0.05)。结论(1)PM可与支气管上皮细胞发生粘附作用；(2)BEAS-2B细胞吞噬PM孢子后,细胞线粒体空泡化,部分出现轻度肿胀,并通过溶酶体将孢子消化破坏,对孢子有一定的破坏作用；(3)PM感染后,BEAS-2B细胞分泌IL-6和IL-8增加,且HIV阴性分离株+LPS的刺激作用较HIV阳性分离组+LPS、FRR2161+LPS、野生分离株+LPS作用弱。