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本论文利用自溶—共固定化酶技术、美拉德反应技术和改良酶—碱制备酵母β-1,3-葡聚糖技术提高啤酒废酵母综合利用价值,主要研究结果如下:
通过比较海藻酸钠和壳聚糖两种载体及不同固定化方法对木瓜蛋白酶和核酸酶P1的共固定化效果,获得了制备木瓜蛋白酶一核酸酶P1共固定化酶的优化工艺条件:以海藻酸钠为载体,采用交联.包埋.交联法进行两种酶的共固定化,木瓜蛋白酶给酶量600kIU/g载体,核酸酶P1给酶量120kIU/g载体,海藻酸钠浓度4%,前交联戊二醛体积分数1.8%,前交联时间4h,前交联温度25℃,酶珠在2%CACl2溶液中的硬化时间2h,后交联戊二醛体积分数0.12%。在优化条件下,木瓜蛋白酶的酶活回收率达60.6%,核酸酶P1的酶活回收率达58.3%,共固定化酶珠中木瓜蛋白酶的酶活达16329IU/g,核酸酶Pl的酶活达3635 IU/g。
通过研究木瓜蛋白酶一核酸酶P1共固定化酶的性质,结果表明共固定化酶的热稳定性、耐pH值能力、最适反应温度和最适作用pH比游离酶有较大提高,共固定化酶的使用寿命明显长于游离酶,连续使用8次,酶活仍保留50%以上。
通过对木瓜蛋白酶一核酸酶P1共固定化酶、游离木瓜蛋白酶、游离核酸酶P1、固定化木瓜蛋白酶和固定化核酸酶反应的动力学进行研究,分别获得了共固定化酶、游离木瓜蛋白酶、游离核酸酶P1、固定化木瓜蛋白酶和固定化核酸酶反应的动力学参数:游离木瓜蛋白酶的最大反应速度为11.2mg/(mL.min)、米氏常数为4.2mg/ml,固定化木瓜蛋白酶的最大反应速度为6.4mg/(mL.min)、米氏常数为10.2mg/ml,共固定化木瓜蛋白酶的最大反应速度为6.2mg/(nd.min)、米氏常数为11.3mg/ml:游离核酸酶P1的最大反应速度为9.1mg/(mL.min)、米氏常数为5.9mg/ml,固定化核酸酶的最大反应速度为6.0mg/(mL.min)、米氏常数为12.5mg/ml,共固定化核酸酶P1的最大反应速度为5.8mg/(mL.min),米氏常数为13.7mg/ml。经比较分析表明,共固定化酶的米氏常数和最大反应速度与木瓜蛋白酶和核酸酶P1单独固定化所得固定化酶接近,说明木瓜蛋白酶和核酸酶P1经共固定化后彼此没有干涉作用,证明了木瓜蛋白酶与核酸酶P1共固定化的可行性。
通过正交试验,获得了自溶一共固定化酶制备啤酒酵母抽提物的最优化工艺条件:酵母乳液浓度8%、共固定化酶珠4%、pH值6.5、温度60℃、反应时间10h。在最优化条件下,啤酒酵母的蛋白质利用率达92.8%、核酸利用率达85.7%,制成品总氮达11.2%、游离氨基酸态氮含量达4.1%、5’-核苷酸含量达6.2%。通过对自溶工艺、自溶.游离酶工艺和自溶一共固定化酶工艺制备啤酒酵母抽提物的各项技术指标进行比较研究,结果显示:自溶工艺抽提率46.3%、蛋白质利用率55.4%、核酸利用率38.2%,成品中游离氨基酸态氮含量1.1%、5’-核苷酸含量0.6%;自溶-游离酶工艺抽提率达78.3%、蛋白质利用率达93.1%、核酸利用率达91.2%,成品中游离氨基酸态氮含量达4.2%、5’-核苷酸含量达6.7%;自溶一共固定化酶工艺抽提率达77.5%、蛋白质利用率达92.8%、核酸利用率达85.7%,成品中游离氨基酸态氮含量达4.1%、5’-核苷酸含量达6.6%。表明用自溶.游离酶工艺和自溶一共固定化酶工艺制备啤酒酵母抽提物明显优于自溶工艺,而自溶-游离酶工艺和自溶-共固定化酶工艺制备啤酒酵母抽提物的各项指标相当接近,说明共固定化酶应用于制备啤酒酵母抽提物可达到添加游离蛋白酶和核酸酶P1相似的效果。
通过研究共固定化酶在啤酒酵母抽提物生产过程中的操作稳定性,结果表明共固定化酶在啤酒酵母乳液体系连续使用10次后,蛋白酶和核酸酶P1的酶活均能保持50%以上。连续使用10次以后,抽提率仍达59.1%、蛋白质和核酸利用率分别达68.5%和164.3%,制成品酵母抽提物的总氮、总核酸、游离氨基酸态氮和5’-核苷酸含量分别达9.2%、5.6%、2.8%和13.7%,这些指标仍明显高于自溶工艺。共固定化酶连续使用10次所产生的总效果相当于自溶一游离酶工艺加入等量游离酶单独作用8次的积累效应,充分显示共固定化酶的优越性及在啤酒酵母抽提物制备过程中应用的可行性。
通过正交试验,获得了美拉德反应制备风味化啤酒酵母抽提物的最优化工艺条件:啤酒酵母抽提物配制成50%浓度,添加1.5%木糖、1.5%核糖、1%半胱氨酸、1%蛋氨酸、0.5%硫胺素和0.5%VC,调节pH7.5,在反应釜内升温至105℃,保温回流反应2h,在此条件下制成品具有肉香浓郁、滋味饱满、圆润、鲜美、肉质感强等特点。
采用GC-MS对美拉德反应前后啤酒酵母抽提物的挥发性风味物质进行分析,探明了美拉德反应与提升啤酒酵母抽提物整体风味的关系:啤酒酵母抽提物通过美拉德反应产生了吡咯、吡啶、吡嗪、呋喃、硫醇等风味物质。啤酒酵母抽提物在美拉德反应前,仅含有醇、醛、酮等11种挥发性风味物质,含量仅722.3 mg/kg;而通过美拉德反应后,其挥发性风味成分在原酵母抽提物风味成分的基础上增加了32种化合物,含量提高到1381.5 mg/kg,包括1种酯、2种醛、3种酮、6种吡咯、9种吡啶、3种呋喃、4种硫醇、2种吡嗪、1种噻唑和1种噻吩,这些化合物可提升啤酒酵母抽提物的整体风味和滋味,其中吡咯、吡啶、吡嗪、呋喃、硫醇等可完美地体现肉滋味和肉香味。挥发性风味物质种类的增加使啤酒酵母抽提物的滋味更饱满,挥发性风味物质含量的增加使啤酒酵母抽提物的香味更浓郁。对常规酶-碱法制备酵母β-1,3-葡聚糖的工艺进行改进,获得了改良酶一碱法制备高纯度、大分子酵母β-1,3-葡聚糖的最优化工艺条件,该改良工艺分两步:第一步是碱性蛋白酶在弱碱环境下去杂蛋白,优化条件为酵母自溶残渣浓度10%、碱性蛋白酶采用Acalase2.4L、碱性蛋白酶添加量2000IU/g酵母残渣,pH8.0,温度60℃,酶解时间4h;第二步是弱碱纯化酵母p.1,3-葡聚糖粗制品,优化条件为β-葡聚糖粗品浓度10%、NaOH浓度2%、70℃反应4h、重复处理4次。在优化工艺下,β-1,3-葡聚糖得率达26.85%,成品杂蛋白含量仅0.42%,成品β-葡聚糖分子量达198.3Kdalton。
探讨了一种制备水溶解性β-1,3-葡聚糖硫酸脂的新方法,最优化工艺条件为:β-1,3.葡聚糖浓度10%,氯磺酸用量10ml,反应温度65℃,反应时间3h。在优化的反应条件下,酵母β-1,3-葡聚糖硫酸酯的取代度达0.91。制成品酵母β-1,3-葡聚糖硫酸酯具有良好的水溶性,经红外光谱分析表明硫酸化没有破坏酵母β-1,3-葡聚糖主链的结构,从而不影响成品的生物活性。