论文部分内容阅读
目的 构建含CMV启动子、pp65全长和分泌肽的PcDNA5.0转染载体(即HCMV粗制基因疫苗)，转染至CHO细胞，建立HCMV pp65蛋白的高效表达系统，为研制HCMV基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法 将HCMV AD169株感染WI-38细胞，收集上清作为实验用的模板，应用PCR法扩增pp65全长，转化到pUC118HincⅡ／BAP质粒载体，测序；构建自制的含CMV启动子、pp65和分泌肽基因的PcDNA5.0转染载体，即扩增含CMV启动子及其上下游序列，克隆测序作为新的CMV启动子，人工合成小鼠IgK链分泌肽与pp65基因进行酶切、连接，应用交换引物的PCR法鉴定。同时应用脂质体法将该载体转染至CHO细胞，加入潮霉素进行筛选，收集CHO细胞的上清液进行纯化，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(考马斯亮蓝染色)、Westen-bloting和Western-ECL system斑点杂交鉴定pp65蛋白。结果 1．克隆pp65全长在TaKaRa Biotech公司测序结果与Medline上HCMV AD169株上的pp65标准序列比较：一致性为99.94％，仅在第1455个碱基有差异，由密码子CCG突变为CCA。2．成功构建了含有分泌肽、CMV启动子(含有增强子和内含子)和pp65全长PcDNA5.0的转染载体，应用交换引物的PCR法鉴定和CHO细胞转染的结果证实：构建PcDNA5.0的转染载体成功。3．载体转染到CHO细胞后，在上清中收集的表达蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电安徽医科大学硕士学位论文泳、western一EeL system斑点杂交和westen一bloting鉴定为纯化的pp65蛋白，可作为HCMV亚单位疫苗研制的主要蛋白抗原。结论1成功地完成J’pp65全长的基因克隆。2.构建了含有分泌肤、CMV启动子和pp65cDNA的pcDNAS.o真核载体(即粗制的HCMV基因疫苗)。3.PP65蛋白在CHO乡l}胞成功地表达，为研制HCMV基因_I_程亚单位疫苗提供了病毒蛋白的抗原