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单核细胞增生性李斯特氏菌是一种重要的人畜共患病病原菌。李斯特氏菌病的危害近年来引起了世界各国食品和卫生部门的广泛关注，如何找到一种快速、敏感特异、合理的检验方法，是当今各国食品卫生部门要解决的重要研究课题。本试验利用PCR方法检测样品中的单核细胞增生性李斯特氏菌，试验共分两个部分，试验一是对165份不同鸡肉样品进行单核细胞增生性李斯特氏菌分离鉴定，本试验采用用国标法进行细菌的分离与培养，用API LISTERIA生化试剂盒等方法进行鉴定，同时用ELISA（mini VADAS自动免疫荧光检测仪）方法对API LISTERIA生化试剂盒鉴定的结果进行验证。细菌分离的结果表明，165份鸡肉样品中有16份样品分离出单核细胞增生性李斯特氏菌，阳性率为9.7％，其中以熟鸡肉串的阳性率最高为13.3％，去皮胸肉的阳性率最低为8.0％。用ELISA方法验证API LISTERIA生化试剂盒鉴定的结果表明，这两种方法鉴定结果的相同。试验二是应用聚合酶链式反应（PCR）方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌。单核细胞增生性李斯特氏菌的主要毒力基因有溶血素O基因（hly基因）、内化素inlA基因和ActA基因等，其中hly基因是最重要的毒力基因，它不仅能使单核细胞增生性李斯特氏菌逃避吞噬体的吞噬作用，还能损伤红细胞、巨噬细胞和血小板。鉴于此本研究根据GENBANK中发表的单核细胞增生性李斯特菌的hly基因序列进行分析比较，采用Fitter等设计的引物序列，扩增hly基因的部分片段，预计扩增片段的长度约为730bp，建立PCR检测方法，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果证明为特异性的核酸片段。在建立方法的同时，优化了反应条件，如MgCl2浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、引物浓度、模板用量以及循环参数等，优化的结果表明25ul反应体系中，最佳MgCl2浓度为2.5mmol／1，最佳酶的用量为1.25U，最佳dNTP浓度为200umol／1，最佳引物用量为25pmol／ul的上、下游引物各0.5ul，最佳退火温度为60.0℃，最佳循环参数为30个循环等。本试验采用碱裂解法提取模板DNA，这种方法比试剂盒提取方法操作简便，而且经济，快速。在建立PCR方法的同时，进行了敏感性试验、特异性试验、干扰性试验及稳定性试验，试验结果表明，该种方法的敏感性为7.3cfu／ul，检测极限为0.038cfu／ul，具有较好的敏感性；本试验用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌等8种非李斯特氏菌和2株英诺克李斯特氏菌、1株绵羊李斯特氏菌、1株威尔斯李斯特氏菌共4株同属异种菌检测这种方法的特异性，试验结果表明，阳性对照菌特异的扩增出目的片段，而同属异种菌均呈阴性反应；用肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌吉林农业大学硕士论文鸡肉食品中LMO的分离鉴定与PCR方法检测的干扰试验结果表明，该种方法不受其它杂菌的干扰;4次分别在不同时间提取模板进行PCR扩增，4次均能特异的扩增出目的片段，试验结果表明该种方法的稳定性很好。应用所建立的PCR方法对分离的16份阳性样品进行检测，检测的结果表明16份样品PCR方法检测均为阳性。比较试验一和试验二两种方法的不同，PCR方法检测时间明显短于试验一的方法，整个检测过程可于3d内完成，更适合于食品的快速检验。 通过本试验的研究表明，扩增单核细胞增生性李斯特氏菌h ly基因部分片段，可以特异地检测单核细胞增生性李斯特氏菌，而与同属异种菌无交叉反应。所建立的方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌具有较好特异性、敏感性和稳定性，与常规方法相比，明显优于常规方法。