目的:建立一种新型的快速、高通量的埃可病毒25型(ECHO25)中和抗体检测方法,并初步评价其在ECHO25中和抗体筛选和血清流行病学调查中的应用价值。方法:应用免疫荧光方法筛选ECHO25高亲和性抗体并将其作为检测单抗,结合酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立ECHO25中和抗体检测方法;使用不同效价的血清评价该方法的准确性;采用所建立的中和方法对ECHO25单克隆抗体、临床血清样品进行检测。结果:建立了快速检测ECHO25中和抗体的Nt-ELISPOT方法,以ECHO25单克隆抗体5B9作为检测抗体;相比经典的中和实验方法 Nt-CPE,该方法可显著缩短检测时间(从5~7 d缩短至1 d以内),检测结果具有较好的一致性;采用所建立的Nt-ELISPOT方法首次筛选获得3株对ECHO25具有较好中和能力的单克隆抗体;临床血清样品检测结果显示厦门地区可能存在ECHO25的流行。结论:该方法可以应用于中和抗体筛选和血清学的临床辅助诊断,为ECHO25的防治研究提供支持。