肿瘤已成为威胁人类健康的三大杀手之一,而化学药物治疗是肿瘤治疗的主要手段之一但是化疗药物的毒副作用和肿瘤细胞的抗药性往往局限了其抗癌效果。有报道显示磁场可抑制肿瘤细胞的生长,且与化疗药物联合作用时,可增强化疗药物对肿瘤细胞的细胞毒性。这些发现使磁场成为抗肿瘤治疗中可应用的方法之一。由于磁场作用的复杂性,选取静磁场进行抗肿瘤研究易于深入进行。但目前静磁场及静磁场联合抗癌药物杀伤肿瘤细胞效应的相关研究较少,机制亦不清楚。本文的研究从调查静磁场及静磁场联合抗癌药物作用下肿瘤细胞生长活性的变化入手,进而分析了静磁场及静磁场联合抗癌药物对肿瘤细胞的周期分布、DNA损伤、表面形貌和内部超微结构的影响及改变,分析并比较了静磁场及静磁场联合抗癌药物对多种肿瘤细胞杀伤效应,为阐明静磁场及静磁场联合抗癌药物的作用机制提供了实验依据。利用AFM、HPLC和原子吸收光谱等技术深入研究了静磁场联合顺铂杀伤K562细胞的可能机理,为磁场联合抗癌药物的应用提供了研究基础。本论文以8.8mT静磁场为实验工具,通过对曝磁细胞不同生活状态与结构特征的检测,分析和比较了磁场对不同来源肿瘤细胞(人白血病细胞K562、人结肠癌细胞SW-480、人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2、小鼠肝癌细胞Hepa1-6)和原代小鼠肝细胞的生物学效应。在此基础上,检测了K562细胞和Hepa1-6细胞被静磁场结合不同抗癌药物作用后的细胞活性、周期分布、DNA损伤和表面形貌和内部超微结构变化,以了解磁场与药物对细胞的联合杀伤机制。在磁场联合顺铂杀伤K562细胞的实验中,通过对曝磁前后K562细胞DNA形貌的观察、胞内药物浓度变化和细胞P-糖蛋白表达的检测,发现磁场作用下顺铂协同杀伤K562细胞的机制涉及胞内顺铂浓度的增加。用三种人源肿瘤细胞系(SW-480细胞、SMMC-7721细胞和HepG2细胞)检测磁场阿霉素联合作用下的细胞活性、周期分布、DNA损伤和胞内ROS的变化,了解了磁场联合阿霉素对人源不同肿瘤细胞的杀伤效应与胞内DNA损伤和氧自由基的产量相关。通过实验研究,本论文获得以下结论：1.采用MTT法、流式细胞技术、单细胞凝胶电泳、原子力显微镜和透射电镜等方法检测并比较磁场对不同肿瘤细胞(K562、SW480、SMMC-7721、HepG2和Hepa1-6细胞)和乳鼠肝细胞的生物学效应。结果表明静磁场对不同肿瘤细胞均有生长抑制作用,但对细胞产生生长抑制作用的时间不同,K562细胞为曝磁24h,SW480细胞为36h, SMMC-7721为6h, HepG2细胞为24h, Hepa1-6细胞为36h。作者认为这一现象涉及肿瘤细胞系的增殖速率,实验显示增殖较快的细胞较易受到磁场的影响,如K562与SMMC-7721细胞。静磁场对细胞的作用有积累效应。分析曝磁后的细胞周期分布发现曝磁可导致K562细胞的G2/M期比例升高,Hepa-6细胞则被阻滞在S期,HepG2细胞曝磁后发生G1期阻滞,但是曝磁对SW480细胞和SMMC-7721细胞的周期分布影响不明显。该结果提示曝磁对不同肿瘤细胞的细胞周期分布变化的影响与细胞的周期世代有关,曝磁时间若短于细胞的周期世代,则难以观察到曝磁对细胞周期分布的影响(例如SW480和SMMC-7721细胞)。单细胞凝胶电泳的结果显示K562细胞曝磁24hDNA损伤显著高于对照(P<0.01),SW480细胞、HepG2细胞和Hepa1-6细胞均在曝磁36h后,DNA损伤明显增加,而SMMC-7721细胞则在曝磁9h时表现出磁致DNA损伤。免疫荧光技术检测发现Hepa1-6细胞和HepG2细胞的微丝骨架系统对磁场的响应不同,曝磁的Hepal-6细胞贴壁和铺展受磁场影响较小,细胞粘附性强；而曝磁阻碍了HepG2细胞的贴壁和铺展。实验数据表明静磁场可诱导肿瘤细胞的周期阻滞,该效应既涉及细胞DNA损伤,又与细胞粘附性以及微丝骨架系统在磁场中的变化相关。对K562细胞、SW480细胞和Hepa1-6细胞的表面精细结构观察发现表面精细结构的改变早于磁场产生生长抑制的时间,K562细胞在曝磁3h后即可发现细胞表面出现微小的孔洞,而SW480细胞则在曝磁12h后可见明显的孔洞样结构,Hepa1-6细胞曝磁24h时表面的粗糙度明显增加。结果显示在曝磁细胞生长抑制现象出现之前,其表面精细结构业已改变。因此可知细胞膜是细胞对静磁场较为敏感的细胞器之一。磁场对肿瘤细胞的抑制效应是一综合作用的结果。对不同的肿瘤细胞,磁场作用的效果不同,这可能是不同作者的实验结果不同的原因之一。原代培养的乳鼠肝细胞经曝磁后,其细胞增殖在36h内未见明显变化,曝磁后G1期略有升高,细胞表面形貌亦未见明显变化。实验提示正常细胞对磁场的敏感性低于肿瘤细胞。2.采用MTT法、流式细胞术、单细胞凝胶电泳、原子力显微镜等技术,研究磁场联合不同抗癌药物(顺铂、阿霉素、紫杉醇、环磷酰胺和喜树碱)对K562细胞和Hepa1-6细胞的杀伤效应。结果表明在磁场作用下,不同抗肿瘤药物对K562细胞的杀伤浓度均降低且杀伤效果增强。环磷酰胺的有效杀伤浓度由单独作用时的1.6mg/mL降低至联合作用时的0.4mg/mL;紫杉醇则由50ng/mL降低到10ng/mL;阿霉素的杀伤浓度从单独作用下的35ng/mL降低为联合作用下的25ng/mL;顺铂由20μg/mL降低至1Oμg/mL。但对Hepal-6细胞而言,磁场与药物联合作用未能降低药物的杀伤浓度,只是增强了药物的细胞毒性。我们推测这一现象可能涉及细胞系的物种生物学特性。流式细胞术分析显示环磷酰胺、紫杉醇和阿霉素均可引起K562细胞和Hepal-6细胞的G2/M期阻滞,顺铂则引起细胞的S期阻滞。当磁场与抗癌药物联用时,磁场不同程度的加强了这些抗癌药物的细胞周期阻滞作用。彗星电泳结果表明磁场增强了作用于DNA的药物(环磷酰胺、阿霉素和顺铂)对K562和Hepal-6细胞DNA的损伤,而紫杉醇单独或联合磁场时,对细胞DNA的损伤效应因细胞系不同而略有差别。喜树碱无论单独是联合磁场均未能对细胞DNA造成损伤。这些结果表明磁场可增强抗癌药物所诱导的细胞周期阻滞。同时,磁场增强了以DNA为靶点的抗癌药物对肿瘤细胞DNA的损伤,如环磷酰胺、阿霉素和顺铂。实验数据提示细胞DNA损伤可能导致细胞周期阻滞。对以微管为靶点的紫杉醇而言,细胞DNA的损伤与细胞特性相关。磁场与喜树碱所引发的周期阻滞未涉及到DNA损伤效应。AFM观察发现药物与磁场联用后,加剧了细胞表面精细结构的损伤。3.通过AFM、高效液相色谱法、火焰原子吸收光谱法和免疫荧光标记技术分别对磁场联合顺铂作用后K562细胞的DNA形貌、胞内顺铂含量和P-糖蛋白表达的变化进行观察和检测,探究磁场联合顺铂杀伤K562细胞的可能机理。实验数据显示磁场联合顺铂处理后,细胞DNA损伤不同于单独顺铂处理时DNA链的碎片和念珠状结构,而是出现了多部位交联且彼此扭结缠绕,形成团块样结构；对细胞外液中铂含量的检测发现磁场联合顺铂组的细胞外液中铂吸收值极显著的低于单纯顺铂组(P<0.01)；顺铂作用可导致细胞P-糖蛋白表达率显著高于对照组(P<0.05),而磁场联合顺铂作用后,其表达率降低,与对照无显著性差异(P>0.05),而与单独顺铂组有显著性差异(P<0.05)。实验结果表明顺铂可诱导K562细胞P-糖蛋白的表达而产生抗药性,而磁场部分逆转了顺铂诱导的细胞表面P-糖蛋白的表达,促进了顺铂在胞内的累积。磁场协同顺铂对细胞的杀伤机制涉及磁场作用下胞内顺铂浓度的增加。4.利用MTT法、流式细胞术、单细胞凝胶电泳、原子力显微镜和ROS检测等手段,研究磁场联合阿霉素对不同肿瘤细胞(SW480、SMMC-7721、HepG2细胞)的杀伤效应和可能机理。实验结果表明静磁场联合阿霉素可对多种人源肿瘤细胞产生协同杀伤作用,磁场存在时,不仅可增强阿霉素对肿瘤细胞的杀伤作用,而且可降低阿霉素的浓度。静磁场联合阿霉素对人源肿瘤细胞周期分布的影响表现为K562细胞和SMMC-7721细胞被阻滞于G2/M期；HepG2细胞和SW480细胞被阻滞于G1期。这一现象涉及细胞的增殖特性。静磁场联合阿霉素对人源肿瘤细胞的DNA损伤与磁场和/或阿霉素作用下胞内ROS水平升高相关。实验发现细胞本身的ROS水平决定了细胞对外源因素引发的ROS水平变化的敏感性。实验数据表明,阿霉素与磁场共同促进了细胞内ROS的生成,并增加了细胞DNA的损伤,该效应涉及阿霉素与磁场对肿瘤细胞的协同杀伤。综上所述,本研究证实了静磁场可抑制肿瘤细胞的生长,并可增强抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤。其机制可能是：1.磁场通过损伤肿瘤细胞的DNA,进而影响细胞DNA复制。特别是当磁场与以DNA为靶点的抗癌药物联合使用时,增强了这些药物对肿瘤细胞DNA的损伤。当细胞DNA损伤积累到一定程度时,即表现为肿瘤细胞的增殖减缓或生长受到抑制。2.磁场影响了带电生物大分子。磁场可影响细胞内的离子运动和电荷极性分布的生物大分子或细胞器,如细胞膜、Ca2+的释放、微管和微丝的解聚或组装等。当这些分子或离子在静磁场中运动时,会受到洛伦兹力的作用,干扰离子运动状态,产生某些生物效应。但是对原代小鼠肝细胞的检测表明磁场对正常细胞的影响不明显。可能是磁场对细胞内带电粒子的作用影响了肿瘤细胞自身的生物节律,该影响经过积累可表现为一系列生物效应。3.磁场可影响细胞膜上定位的某些蛋白,如P-糖蛋白,从而影响了其功能,导致胞内抗癌药物浓度的积累。4.磁场可诱导细胞内ROS的水平升高。肿瘤细胞自身的ROS水平决定了细胞对外源因素引发的胞内ROS水平变化的敏感性。当肿瘤细胞自身ROS水平较高时,对可诱导ROS产生的抗癌药物的敏感性增高,药物与磁场联合作用后,可较大幅度降低药物的杀伤浓度,而药物浓度的降低则有利于减少对机体的毒害。