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目的:脉络膜新生血管是许多眼底疾病共有的临床表现和病理性改变,对患者的中心视力造成不可逆性损伤。脉络膜新生血管的确切发病机理尚不明确,治疗方面仍有许多问题尚待解决。我们前期研究证实,活化Rap1在实验性CNV视网膜色素上皮细胞内的表达较正常组织内减少,表明Rap1与CNV的形成有关。在此基础上,又进一步通过体内激活Rap1观察其对RPE屏障完整性以及CNV的作用,证明GTP-Rap1在CNV的生成中的重要角色。那么活化Rap1如何加强RPE屏障功能进而减少CNV形成呢?近年研究发现,GTP-Rap1可与NADPH氧化酶亚基p22phox结合进而抑制NADPH氧化酶诱导ROS的产生。此外有作者观察到,应用抗氧化剂apocynin通过抑制ROS对RPE屏障完整性的破坏进而减少CNV的形成。我们设想,活化Rap1是否通过抑制ROS对RPE屏障的破坏作用来抑制CNV形成的呢?本实验利用激光诱导建立BN大鼠CNV模型,通过向玻璃体腔注射8cpt-cAMP激活Rap1,以apocynin为抗氧化剂,观察GTP-Rap1是否通过抑制氧化应激通路来增强RPE屏障完整性从而减少CNV生成,探讨GTP-Rap1抑制实验性CNV形成的作用机制。方法:1分组:健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠60只,雌雄不限,8-10周,经眼科检查双眼底及前节均未见明显异常,随机分为3组,分别为激光模型组、玻璃体腔注射8cpt-c AMP组(8CPT组)及腹腔注射apocynin组(APO组),每组20只BN大鼠(40只眼)。2 CNV模型建立:氪激光(激光参数:波长647nm,光斑直径200μm,功率260mW,曝光时间0.05s),围绕视盘在视网膜大血管之间均匀光凝9-10个点,当看到视网膜光凝处有气泡产生可证明Bruch膜被击穿,成功建立CNV模型。3给药:激光造模后8CPT组立即玻璃体腔注射8cpt-cAMP,注射剂量为1μl。激光造模之前APO组腹腔注射apocynin,注射剂量为:0.1ml(10mg/kg/d),连续5天。观察时间:激光后5天。4real-timepcr:激光后5天,三组中随机各选取5只bn大鼠(10只眼),腹腔麻醉后立即摘除大鼠眼球,real-timepcr检测p22phox/nox4、occludinmrna水平,将上述指标进行组间比较。5westernblot:激光后5天,从三组中随机各选取5只bn大鼠(10只眼),腹腔麻醉后立即摘除大鼠眼球,westernblot检测p22phox/nox4、occludin蛋白表达水平,将上述指标进行组间比较。6荧光探针(dcfh-da)及流式细胞仪:激光后5天,从三组中随机各选取5只bn大鼠(10只眼)。腹腔麻醉后立即摘除大鼠眼球,制作rpe单细胞悬液,利用荧光探针(dcfh-da)装载rpe细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察rpe细胞内荧光强度,流式细胞仪检测rpe细胞内ros水平,将上述指标进行组间比较。7脉络膜血管铺片:激光后5天,从三组中随机各选取5只bn大鼠(10只眼)。腹腔麻醉后颈动脉注射1ml异硫氰酸荧光素-葡聚糖,将bn大鼠眼球分离出,制作脉络膜血管铺片完成后,激光扫描共聚焦显微镜观察cnv形成情况,通过测量cnv的形成面积来进行组间比较。结果:1抗氧化剂apocynin抑制rpe-脉络膜-巩膜组织中的p22phox/nox4表达。激光后5天,p22phox/nox4mrna和蛋白表达apo组较激光模型组减少,差异有统计学意义(t=6.834,p<0.001;t=6.717,p<0.001)。2活化的rap1抑制rpe-脉络膜-巩膜组织中的p22phox/nox4表达。激光后5天,p22phox/nox4mrna和蛋白表达8cpt组较激光模型组减少,差异有统计学意义(t=7.834,p<0.001;t=6.533,p<0.001)。3抗氧化剂apocynin增加rpe-脉络膜-巩膜组织中的occludin表达。激光后5天,occludinmrna和蛋白表达apo组较激光模型组增多,差异有统计学意义(t=-5.772,p<0.001;t=-6.763,p<0.001)。4活化的rap1增加rpe-脉络膜-巩膜组织中的occludin表达。激光后5天,occludinmrna和蛋白表达8cpt组较激光模型组增多,差异有统计学意义(t=-5.797,p<0.001;t=-6.480,p<0.001)。5抗氧化剂apocynin抑制rpe细胞内的ros水平。激光后5天,激光扫描共聚焦显微镜观察,ros在激光模型组呈绿色强荧光,apo组呈绿色弱荧光。流式细胞仪检测rpe细胞内ros表达水平,与激光模型组相比APO组明显减少,差异有统计学意义(t=5.927,P<0.001)。6活化的Rap1抑制RPE细胞内的ROS水平。激光后5天,激光扫描共聚焦显微镜观察,ROS在激光模型组呈绿色强荧光,8CPT组呈绿色弱荧光。流式细胞仪检测RPE细胞内ROS表达水平,与激光模型组相比8CPT组呈减少趋势,差异有统计学意义(t=6.197,P<0.001)。7抗氧化剂apocynin抑制CNV生成面积。激光后5天,CNV生成面积,APO组与激光模型组相比减少,差异有统计学意义(t=8.601,P<0.001)。8活化的Rap1抑制CNV生成面积。激光后5天,CNV生成面积,8CPT组与激光模型组相比呈减少趋势,差异有统计学意义(t=7.034,P<0.001)。结论:GTP-Rap1可以增强RPE屏障完整性,减少实验性CNV的形成,其机制可能与抑制氧化应激产生的ROS相关。