与哺乳动物相比,鸡胚具有易于获取和操作、结合病毒转染和电转移可进行转基因操作等优势,因而常被作为发育生物学和比较医学研究的模型动物。尤其是近年来有关鸡胚各种组织器官发育分子机理的研究进展较快,这为鸡胚更好的作为模型动物奠定了一定的基础。为了更深层次揭示细胞发育和分化的机理,在内源性调节的基础上力图通过外源性调控,在体外获得干细胞来源、可用于组织功能修复的组织和器官,本实验以艾维因鸡胚为材料,分离了胚胎期原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)并通过传代培养获得了大量胚胎生殖(embryonic germ cell, EG)细胞,建立了EG细胞体内形成畸胎瘤及体外形成类胚体(embryoid body, EB)的模型,探讨了多种因素对EG细胞体外多向分化的调控,研究了EG细胞体外向成熟神经细胞、脂肪细胞、肝细胞和心肌细胞分化的潜能。1.鸡胚胎生殖细胞分离和培养模型的建立在体视显微镜下用玻璃细针分离3.5-4日胚龄鸡胚生殖嵴部位,用胰蛋白酶-EDTA消化分散组织,然后将分散的细胞进行培养以建立PGC的原代培养模型。所用的高糖DMEM培养液中添加5%胎牛血清(FCS)、10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、10ng/ml干细胞生长因子(SCF), 0.1mmol/L MEM非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L L-谷氨酰胺(Gln)、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(完全培养液)。与体细胞共培养5d后,利用RT-PCR方法检测PGC特异性基因Cvh、Dazl和DEH在原代培养形成的PGC集落中的表达。将表达PGC特异基因的集落进行传代培养,然后用过碘酸雪夫氏反应(PAS)、SSEA-1和SSEA-3及SSEA-4免疫组化、和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox2 RT-PCR检测均证实传代后形成的集落为EG阳性克隆。上述结果表明,PGC-体细胞原代及传代共培养并添加多种因子的条件下,PGC在体外可转变为EG细胞,这为研究生殖干细胞的分化机制提供了细胞来源。2.鸡胚胎生殖细胞体内形成畸胎瘤通过灌饲具有免疫抑制作用的药物环孢素A (CsA,5mg/kg)制作免疫抑制雏鸡,将含有1.0×106个鸡EG细胞的PBS注射到受到免疫抑制的雏鸡皮下,观察其分化情况。5周后取皮下形成的组织瘤进行切片和HE染色及免疫组化染色鉴定。结果表明,EG细胞在免疫缺陷的雏鸡皮下可自发分化为含有神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管、骨细胞、平滑肌、横纹肌和腺上皮细胞等三个胚层来源的多种细胞类型的畸胎瘤。而注射同样数量EG细胞到未饲喂环孢素A组(模型对照组)和注射不含有EG细胞的免疫抑制雏鸡组(细胞对照组)均未观察到组织瘤的形成。上述结果表明通过饲喂免疫抑制作用的药物环孢素A可制作免疫抑制雏鸡模型,本实验利用此模型证明了鸡EG细胞在体内具有多向分化为含有三个胚层来源细胞畸胎瘤的潜能,这为开展生殖干细胞体内分化潜能的研究提供了实验平台。3.鸡胚胎生殖细胞体外形成EB模型的建立与优化将EG克隆与体细胞进行胰酶消化,并利用差速贴壁方法富集EG细胞。然后无饲养层、无LIF和β-巯基乙醇条件下将鸡EG细胞接种到涂有1%琼脂的培养板中悬浮培养形成EB。形成的EB进行丫啶橙(AO)染色后在荧光共聚焦显微镜下观察其内部结构。对形成7d和14d的类胚体分别进行切片和HE组织学染色,并通过RT-PCR检测内胚层标志基因AFP、外胚层标志基因Sox3、中胚层标志基因GATA6和滋养层标志基因Cdx2在其中的表达。结果表明：将富集的鸡EG单细胞采用不含LIF的培养液进行悬浮培养4-7d可形成简单EB,继续悬浮培养则其内部形态也发生改变,最终形成囊状EB。不同时间点的EB切片显示随着时间的变化,EB中出现含有神经细胞、脂肪细胞和胰腺细胞等三个胚层的细胞类型。此外,在体外悬浮培养时比较了FCS和Gln对EB形成的影响。统计显示,随着悬浮培养时间的延长,EB的面积不断增大,FCS浓度和Gln添加量对EB的形成产生影响显著,其中以含15%FCS、2 mmol/L Gln的培养液中EB的形成数量和状态较好。同时,在EG细胞体外分化形成EB的第0d、3d、5d和10d分别检测多能性相关基因转录调控因子如PouV、Nanog和Sox2 mRNA的表达。结果显示：在EB体外分化过程中,调控干细胞多能性和自我更新的三个重要转录调控因子PouV、Nanog和Sox2表达量均呈明显下调趋势,提示PouV、Nanog和Sox2在维持鸡EG细胞多潜能性中起着重要作用。上述结果表明,鸡胚EG细胞通过悬浮培养方法可制备具有向三个胚层分化能力的EB,此结果为研究EG细胞体外定向诱导分化为特定的细胞类型奠定了实验基础。4.鸡胚EG细胞体外多向分化调控的研究在贴壁培养条件下,利用含10-6 mol/L RA的ITS诱导液可将EG细胞定向诱导分化为表达成熟神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞特异蛋白及基因的神经细胞。部分神经元经免疫组化及RT-PCR方法鉴定,表明其具有合成多巴胺和胆碱能神经递质的功能。利用10μg/ml胰岛素、1μmol/L地塞米松和0.2 mmol/L吲哚美辛联合处理,可诱导EG细胞定向分化为含有大量脂滴并表达脂肪细胞特异性基因PPARγ, GLUT1和LPL的成熟脂肪细胞。利用与肝细胞条件培养联合培养的方式可定向诱导EG细胞分化为肝细胞,利用PAS染色、免疫细胞化学、RT-PCR方法鉴定EG诱导来源的肝细胞,提示EG细胞具有分化为含有糖原并分泌白蛋白功能的成熟的肝细胞。利用添加去甲基化试剂5-aza的培养液悬浮培养,可将EG细胞诱导分化为心肌细胞,表明5-aza具有显著提高形成规律性收缩EB比例的作用,其中以添加5μmol／L 5-aza组形成的比例最高。形成的EB经贴壁分化培养后,采用透射电镜观察、荧光免疫组化及RT-PCR方法鉴定EG细胞来源的心肌细胞,结果显示5-aza可诱导EG细胞分化为含有肌小结和缝隙连接、表达心肌细胞特异性蛋白和标志基因的心肌细胞。以上实验结果表明：从鸡胚生殖嵴分离的PGC与体细胞原代共培养并经传代所建立的培养模型可用于EG细胞制备和分化调控的研究,经PAS组化、SSEA-1和SSEA-3及SSEA-4免疫细胞化学染色、干细胞多能性相关基因转录调控因子PouV、Nanog和Sox2的RT-PCR法检测、在免疫抑制雏鸡体内形成含有三个胚层来源细胞的畸胎瘤等多种方法均证实了EG细胞的干细胞特性。将富集的鸡EG细胞悬浮培养形成简单EB和囊状EB,培养液中添加15%FCS和2mmol／L Gln可促进EB的形成。在EB体外分化过程中,PouV Nanog和Sox2表达量均呈明显下调趋势,而三个胚层的标志基因AFP.Sox3和GATA6及滋养层标志基因Cdx2出现表达,表明EG细胞通过悬浮培养方法可制备具有向三个胚层分化能力的EB。贴壁培养的EB经不同的诱导剂处理后,经细胞特异性的标志基因或蛋白的表达鉴定,EB可定向分化成有功能的神经细胞、脂肪细胞、肝细胞及心肌细胞。以上结果提示利用所建立的EG／EB体外制备和定向诱导分化模型可用于生殖干细胞发育调控机制的研究,EG细胞可诱导分化成三个胚层的细胞,这为禽类干细胞发育生物学和比较医学的研究提供了实验平台和理论基础。