研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的自身免疫性疾病,以大量自身抗体产生、补体激活和免疫复合物沉积为主要特征,导致组织和器官损伤。虽然针对SLE的病因和发病机制,已经提出过很多学说,包括自身免疫学说、遗传学说、遗传和环境交互作用学说等,但到目前为止,仍然不清楚SLE发病的确切原因。只有深入研究其发病机制,才能有望寻找到更有效的治疗策略。P2X嘌呤受体7是一种蛋白,由P2RX7基因编码。P2X7R属于由细胞外ATP门控的离子通道家族,但是跟其他P2X受体不同,它很大程度受造血细胞的限制。P2X7R在很多免疫功能中起作用,包括细胞因子的分泌以及淋巴细胞导航受体CD62L的脱落。因为P2X7R缺失鼠表现出抗体诱导型关节炎抵抗以及受损的CD62L脱落和IL-1β分泌,刺激这个受体会促进炎症反应意味着P2X7R在自身免疫病中有潜在的作用。刺激促炎症反应的脂多糖P2X7R可导致IL-1β分泌,细胞凋亡发生率的升高和CD62L脱落。而且,编码人类P2X7R的基因位于12q24区域,这个区域在西班牙和欧洲美国人家族中被证实是狼疮易感位点,叫作SLEB4。以上这些证据均显示,P2X7R可能在SLE的发病中起着重要作用。然而目前关于P2X7R在SLE发病机理中的研究还很有限,本课题组根据最新的研究进展,提出假设:P2X7R基因可能与系统性红斑狼疮的遗传易感性有关,而且P2X7R基因多态性很可能与狼疮肾炎、不同的临床和实验室特征有关。深入研究P2X7R在SLE发病中的作用,将有望找到新的治疗靶点。目的旨在通过较大规模的系统性红斑狼疮遗传流行病学调查,明确P2X7R基因单核苷酸多态性及单倍型与SLE的遗传关联性,结合临床资料探讨P2X7R基因单核苷酸多态性与SLE表型之间的关联性,以及P2X7R基因多态性与P2X7R表达之间的关系。方法病例来自于安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科和安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科的SLE患者。SLE的诊断依据1997年美国风湿病学会修订的SLE分类标准。正常对照为:不符合SLE诊断标准;无重大疾病史;本人或直系亲属无自身免疫性疾病。收集684例SLE患者、410例正常对照检测P2X7R基因多态性。问卷调查收集一般情况和临床资料,并进行SLE疾病活动指数(SLE disease activity index,SLEDAI)评分。获得研究对象知情同意后,抽取外周静脉血和进行问卷调查。选取SLE患者16例和健康志愿者14例,用流式细胞术检测外周血PBMC中淋巴细胞中P2X7R+细胞百分比,淋巴细胞中CD19+P2X7R+细胞百分比,CD4+P2X7R+细胞百分比,分析其变化与P2X7R基因多态性之间的关系。利用ABI 7300系统进行SNP基因分型分析验证P2X7R基因多态性与SLE的关系,并用Plink 1.03软件进行统计分析。用EpiData 3.02软件建立数据库。采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。结果1. P2X7R基因SNPs多态性与SLE遗传易感性关系:位点rs1718119的A/A、A/G、G/G基因型频率在病例组和对照组中分别为0.670%、18.928%、80.402%和3.430%、27.704%、68.865%, A和G等位基因的频率在两组中分别为10.134%、89.866%和17.282%、82.718%,两组间差异有统计学意义。经χ~2检验,无论在病例组还是对照组,位点rs1718119的基因型频率均符合HWE定律(χ~2=0.917,P=0.338;χ~2=0.364,P=0.546)。等位基因G为系统性红斑狼疮发病的危险等位基因,等位基因G携带者是等位基因A携带者系统性红斑狼疮发病危险的1.853倍,GG基因型携带者是AA基因型携带者系统性红斑狼疮发病危险的5.977倍,遗传模型为累加模型。位点rs3751143的A/A、A/C、C/C基因型频率在病例组和对照组中分别为59.900%、35.940%、4.160%和60.302%、34.673%、5.025%,基因型和SLE易感性之间未显示关联;A和C等位基因的频率在两组中分别为77.870%、22.130%和77.638%、22.362%,两组间差异无统计学意义,经χ~2检验,无论在病例组还是对照组,位点rs3751143的基因型频率均符合HWE定律(χ~2=1.101,P=0.294;χ~2=0.001,P=0.977)。位点rs2230911的C/C、C/G、G/G基因型频率在病例组和对照组中分别为67.613%、29.382%、3.0005%和68.766%、28.463%、2.771%,基因型和SLE易感性之间未显示关联;C和G等位基因的频率在两组中分别为82.304%、17.696%和82.997%、17.003%,两组间差异无统计学意义,经χ~2检验,无论在病例组还是对照组,位点rs2230911的基因型频率均符合HWE定律(χ~2=0.045, P=0.832 ;χ~2=0.029 P=0.865)。应用SHEsis软件构建P2X7R基因常见单倍型,结果显示,在中国汉族人群,存在以下7种单倍型结构AAC、AAG、ACC、GAC、GAG、GCC、GCG,AAC单倍型在SLE病例组和对照组间频率差异有统计学意义。rs1718119,rs3751143,rs2230911三个位点连锁不平衡分析, 3个SNPs均存在连锁不平衡。2. P2X7R基因SNPs多态性与LN关系:位点rs1718119的G/G、A/G、A/A基因型频率在LN组和非LN的SLE患者组中分别为77.368%、21.579%、1.053%和81.818%、17.690%、0.491%,基因型和LN易感性之间未显示关联;G和A等位基因的频率在两组中分别为88.158%、11.842%和90.663%、9.337%,两组间差异无统计学意义;位点rs3751143的A/A、A/C、C/C基因型频率在LN组和非LN的SLE患者组中分别为61.053%、34.737%、4.211%和59.367%、36.496%、4.136%,基因型和LN易感性之间未显示关联;C和A等位基因的频率在两组中分别为22.384%、77.616%和21.579%、78.421%,两组间差异无统计学意义;位点rs2230911的C/C、C/G、G/G基因型频率在LN组和非LN的SLE患者组中分别为73.016%、25.397%、1.587%和65.122%、31.220%、3.659%;C和G等位基因的频率在两组中分别为85.714%、14.286%和80.732%、19.268%,两组间差异有统计学意义,等位基因C携带者是等位基因G携带者LN发病危险的1.432倍OR=1.432(1.023-2.005)。3. P2X7R基因SNPs多态性与SLE表型关系:采用病例-病例分析检测SNPs多态性与SLE首发症状的潜在易感性关联, rs1718119与首发口腔溃疡(χ~2=9.894, P=0.006)有统计学关联; rs2230911与首发口腔溃疡(χ~2=12.780,P =0.002),与首发胸膜炎(χ~2=7.311, P=0.028)有统计学关联,其他均无统计学关联。采用病例-病例分析检测SNPs多态性与SLE主要临床特征的潜在易感性关联, rs1718119与口腔溃疡(χ~2=9.455, P=0.007)有统计学关联;rs2230911与口腔溃疡(χ~2=10.329,P =0.006),与神经系统损伤(χ~2=6.235,P =0.049)有关联,其他均无统计学关联。采用病例-病例分析检测SNPs多态性与SLE主要临床表型及实验室特征的潜在易感性关联, rs3751143与视神经损伤(χ~2=5.541, P=0.019),有统计学关联;rs2230911与血小板降低(χ~2=5.909,P =0.015),与白细胞降低(χ~2=7.642,P=0.006)有统计学关联,其他均无统计学关联。4. P2X7R基因SNPs多态性与P2X7R表达的关系:位点rs1718119由于外周血淋巴细胞中P2X7R表达水平在本资料的基因型AA中的无分布,所以只比较在基因型GG与GA之间的差别,结果显示淋巴细胞中P2X7R+细胞百分比在GG与GA之间的差别有统计学意义(P<0.05)。SLE患者P2X7R基因位点rs3751143与外周血淋巴细胞中P2X7R表达水平的关系,在本资料基因型CC中无分布,所以只比较在基因型AA与AC之间的差异如,均无统计学意义。SLE患者P2X7R基因位点rs2230911与外周血淋巴细胞中P2X7R表达水平的关系,在本资料基因型GG中无分布,所以只比较在基因型CC与CG之间的差异,,均无统计学意义。相同基因型病例对照P2X7R表达水平比较,差异均无统计学意义。结论(1) P2X7R基因(rs1718119)多态性在中国汉族人群中与SLE的遗传易感性有关;构建的AAC单倍型与SLE有关联;rs1718119、rs3751143和rs2230911存在连锁不平衡,P2X7R基因可作为SLE候选易感基因。(2) P2X7R SNPs多态性与口腔溃疡、胸膜炎、LN、视神经损伤等SLE的临床表型有关。(3)位点rs1718119基因型GG与GA之间淋巴细胞中P2X7R+细胞百分比的差异有统计学意义,P2X7R基因多态性影响P2X7R表达。