真菌Simplicillium lanosoniveum抗生素和色素的分离、纯化及表征

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本文以Simplicillium lanosoniveum var.tianjinienss Q.L.Dong(真菌DT06)代谢产物为研究对象。发现DT06不仅可以产生具有抗氧化性和分散性的多糖,还能合成抑制金黄色葡萄球菌生长的新型抗生素和具有良好抗氧化性、稳定性的黄色色素。本实验研究了新型抗生素分离纯化方法,对抗生素进行了结构表征;研究了色素分离纯化方法、抗氧化性及稳定性,并优化了色素发酵条件和提取方法。真菌DT06抗生素经过大孔树脂富集、硅胶柱纯化后得到白色晶体,对抗生素进行结构表征发现:紫外-可见光谱显示,抗生素在254 nm处有强烈吸收峰;HPLC分析显示抗生素在8分钟处有单个尖锐峰;质谱显示抗生素的相对分子质量为282.09;核磁H谱图、C谱图显示抗生素分子式中含有12个C和14个H,并且结构中含有双键、三键和多个羟基;红外谱图显示抗生素含有多个羟基、-NH基团和饱和的C-H基团,并且含有碳碳三键和碳氮三键,抗生素的水溶性极好也印证羟基的存在。经过综合分析抗生素应该是一种多羟基吡咯类生物碱,分子式为C12H14N2O6,不饱和度为7个。酸化的乙酸乙酯萃取液经减压蒸馏、甲醇复溶得到高纯度浅黄色色素溶液;紫外可见扫描光谱显示色素甲醇溶液在285 nm处有特征吸收峰;确定了高效液相色谱分析方法,在Kromasil C18柱,流动相为乙腈:水(2:8,V/V)、流速为0.8 mL/min条件下,液相色谱对色素的分离效果最好,在10.52 min左右出现单一峰,峰形陡峭、对称性良好;色素的抗氧化实验表明:色素在0-0.5 mg/mL浓度范围内,随着色素浓度的增加,自由基清除率逐渐增加,对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基及羟基自由基清除率IC50分别为0.08 mg/mL、0.37 mg/mL、0.31 mg/mL、0.24 mg/mL,说明DT06色素具有良好的抗氧化活性;色素的稳定性实验表明:色素在100℃条件下保存5 d后,保存率仍在86%以上,在紫外和12000 LX条件下照射5 d后,色素保存率分别为96.2%和94.2%,说明黄色素具有较好的热稳定性和光稳定性,色素溶液在pH为10时,溶液颜色变深,产生沉淀,吸光度值下降,在酸性条件下色素溶液吸光度值无明显变化,表明色素在酸性条件下稳定,在碱性条件下不稳定。采用Plackett-Burman和响应面设计优化得到DT06色素合成的最佳培养基为:NaNO3 0.68 g/L,K2HPO4 0.48 g/L,MgSO4?7H2O 0.037 g/L,CaCl2?2H2O 0.036 g/L,葡萄糖18 g/L,CS 14.5 mL/L,TM 1 mL/L,经过重复性实验得到优化后培养基中色素吸光度值为1.004,是优化前0.612的1.64倍。通过单因素实验和响应面设计优化得到DT06色素最佳提取工艺参数为:提取有机溶剂为乙酸乙酯,温度为50.4℃,加酸比为9.7:1,料液比为2.37:1,以最佳的工艺条件为基础,测出真菌DT06胞外色素的吸光值为1.008,与此响应面模型预测值吻合,说明所建模型准确可靠。
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