动物转基因研究是目前分子生物学研究的热点内容之一，其基本特征是改变动物的遗传组成，而改变动物遗传组成的目的是多种多样的。在本研究中，我们希望通过改变动物的遗传组成来赋予转基因动物一种新的性状，所用的试验动物为昆明小白鼠。 随着生活水平的提高，肥胖日益成为一种严重的社会问题，现代医学研究表明肥胖与人的糖尿病、心脏稿及高血压有密切关系。由人肥胖基因编码的瘦蛋白是调节脂肪代谢及体重的重要因子之一。能否用转基因动物生产该种蛋白质以及能否将该种蛋白质用于治疗与人肥胖有关的疾病是进行这项研究的目的。 用包含兔乳清酸性蛋白基因启动子及其远端上游区（约6.3kb，-6300bp-+28bp）、人肥胖基因的编码序列（约1.0kb）及兔乳清酸性蛋白基因终止子（约0.2kb）的三个质粒经亚克隆构建了融合表达载体，在构建表达载体之前，我们首先用AB1377 DNA测序仪对人肥胖基因进行了序列测定，测定结果表明该序列包含人肥胖基因第一外显子的最后9bp，完整的第二外显子（172bp）和第三外显子的一部分（包括了全部的编码序列和部分3′非翻译区），编码序列（504bp）中包含典型的翻译起始密码子ATG和终止密码子TGA。用NotⅠ消化表达载体，回收包含上述三个表达元件且插入方向正确的片段（约7.5kb），溶于TE（10 mmol／L Tris·C1，pH 7.4；0.1 mmol／LEDTA）后进行显微注射。注射用的DNA浓度为2μg/ml，每ml注射液中DNA的拷贝数约为2.4×10¹¹，每一枚原核期小鼠胚胎注射1 p1-2 p1。采用标准的显微注射方法，获得48只后代小鼠。四周龄对剪取0.1g左右的小鼠尾巴并提取尾组织DNA。根据rWAP启动子序列及人肥胖基因cDNA的序列设计了两对引物，其序列如下： P₁：5′Tgg，AAg，gAC，Agg，ATg，ggg，Tgg，Ag—3′ P₂：5′—gAT,AAg，gTC，Agg，ATg，ggg，Tgg，Ag—3′ P₃：5′—ggg，ATC，CgT’gCC，gAT,CCA，AAA，AgT，CCA，AgA—3’ P₄：5′—CgA，ATF,CCC，TTC，AAg，gCC，TCA，gCA，CCC，Ag—3′ 对于上述两对引物，预计P₁、P₂的扩增长度为1.1kb，P₃、P₄的扩增长度为460bp。随后的扩增结果表明该方法检测转基冈小鼠的结果不够稳定。以人肥胖基因cDNA为探针，用EcoRI消化总组织DNA，经Southern杂交反复确证其中两只母鼠（2^#与C₃）为转人肥胖基因小鼠。在出生的后代小鼠中，转基因阳性率约为4％（2／48）。基于此，我们认为采用PCR扩增的方法检测转基因动物具有费用低和耗时短的优点，但容易受污染而导致假阳性结果的出现，通过Southern杂交的方法检测转基因动物虽然费用高且耗时长，但效果十分稳定而可靠，我们建议直接采用Southern杂交的方法检测始祖转基因小鼠。两只转基因小鼠与非转基因公鼠交配，妊娠足月分娩后，2^#与C₃分别生出7只和8只仔鼠，Southern杂交结果表明2^#与C₃所生出的仔鼠中各有3只为含有转基因片段的仔鼠，这表明转基因始祖小鼠可正常繁殖并可将转基因传递给后代，其遗传遵循孟德尔遗传规律。将产后第5d的转基因小鼠与仔鼠隔离3h以上，并通过腹腔注射0.3IU的缩宫素和按摩乳房的方法采集其乳汁，以非转基因小鼠产后第5天的奶样为对照进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳的结果表明两只转始祖基因小鼠奶样都较对照一2一华中农业大学博士学位论文奶样多出一条带，大小约为16KDa，与人肥胖基因的表达产物瘦蛋白的分子量接近，初步估计其表达量为lm留ml一Zm留ml。基于此我们认为本研究中所构建的表达载体是一个表达效果良好的载体，6.3kb的r认伙P启动子及其远端上区具有较强的驱动下游基因（包括cDNA）表达的能力，可以用于构建表达其它基因的表达载体。 通过该研究，我们建立了在乳腺中表达人瘦蛋白的转基因动物模型，转基因得到较高水平的表达。以之为基础，在今后的研究中我们可以用该表达载体制作转基因奶山羊或奶牛，该表达载体在大型动物的乳腺中可能同样会有高水平的表达，从奶样中分离纯化该蛋白质并通过动物临床试验确定其生物学效应，该产品可能能够用于与人肥胖有关的疾病的治疗。