【摘 要】
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1993年,Serrano等利用酵母双杂交技术在筛选与人CDK4相关的蛋白时找到一个能有效地抑制CDK4活性、相对分子质量为16 ku的蛋白质,将其命名为p16蛋白。p16基因（p16,MTS1,CDKN2）位
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1993年,Serrano等利用酵母双杂交技术在筛选与人CDK4相关的蛋白时找到一个能有效地抑制CDK4活性、相对分子质量为16 ku的蛋白质,将其命名为p16蛋白。p16基因（p16,MTS1,CDKN2）位于人类第9号染色体短臂2区1带区域(9P21)。PCR和Southern杂交证实在黑色素瘤、神经胶质瘤、肺癌、白血病中p16基因经常发生缺失、重排及转录水平表达的丧失。目前p16研究主要集中在肿瘤发生中p16失活方式及作为抗肿瘤药物研究等方面,在转基因动物水平的研究很少。我们构建p16真核表达载体pCR?3.1/p16,建立其稳定表达的NIH3T3细胞株,应用显微注射法制备携带人p16基因的转基因小鼠,可为将来在个体水平研究p16基因的功能奠定基础。 本研究共分两部分,第一部分是p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立;第二部分是用显微注射法制备携带人p16基因的转基因小鼠。 第一部分 p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立 实验目的 构建pCRR3.1/p16真核表达质粒,并建立其稳定表达的NIH3T3细胞株,为应用显微注射法制备携带人p16基因的转基因小鼠奠定基础。 实验方法 将人的p16cDNA亚克隆至pCR?3.1,构建成pCR?3.1/p16真核表达质粒,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,进行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析,将已鉴定的pCR?3.1/p16经脂质体介导转染至NIH3T3细胞中,获得10个G418抗性克隆,其中2个为RT-PCR阳性。
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