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目的:胰腺癌恶性程度很高,治疗效果非常不理想,是全球所有癌症中导致癌症相关性死亡的主要原因之一。近年来分子靶向药物及免疫治疗等综合治疗措施的进步使得胰腺癌患者的5年总体生存率略有改善,这凸显了阐明胰腺癌发生发展的分子机制及寻找更为有效治疗靶点的重要性。环状RNA作为一类真核生物中普遍表达的非编码RNA分子,广泛参与了胰腺癌等肿瘤的生物学进程。因此,本研究拟筛选胰腺癌中差异表达的环状RNA,了解环状RNA hsa＿circ＿0006117在胰腺癌中的表达及临床意义,并探讨其在胰腺癌中的生物学功能及分子机制,以期为寻找更为精准有效的胰腺癌治疗靶点提供理论依据。方法:1、检索GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库中胰腺癌的环状RNA表达谱,分别下载GSE69362（包含6对胰腺癌及癌旁组织）和GSE79634（包含20对胰腺癌及癌旁组织）的组织芯片,应用生物信息学的方法分析差异表达的环状RNA。Venn图分析确定候选环状RNA并进一步行实时定量逆转录PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）检测其在胰腺癌组织及细胞系中的表达情况,最后选定环状RNA hsa＿circ＿0006117为研究对象。随后,应用PCR扩增（外扩型引物）、琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序、RNase R及放线菌素D实验等鉴定环状RNA hsa＿circ＿0006117的成环特征及是否以环状形式存在于胰腺癌细胞中。进一步利用RNA核浆分离及荧光原位杂交实验（Fluorescent In Situ Hybridization Kit,FISH）确定环状RNA hsa＿circ＿0006117在胰腺癌细胞中的亚细胞分布,并利用胰腺癌组织及癌旁组织中环状RNA hsa＿circ＿0006117的相对m RNA表达量绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）评价其在胰腺癌中的潜在诊断价值。2、针对环状RNA hsa＿circ＿0006117的背向剪切位点,设计3条小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）进行干扰效率验证,同时检测其是否会干扰其亲本基因蛋白质酪氨酸磷酸酶受体A（protein tyrosine phosphatase receptor type A,PTPRA）的表达。将干扰效率最显著的2条si RNA转染到胰腺癌PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞中进行CCK-8、克隆形成、划痕愈合、transwell迁移及侵袭等体外细胞功能实验,检测其对胰腺癌增殖及迁移侵袭能力的影响。随后,选取细胞功能实验验证有效的si RNA序列构建短发卡RNA（short hairpin RNA,sh RNA）进行祼鼠皮下成瘤实验,体内验证环状RNA hsa＿circ＿0006117对胰腺癌增殖能力的影响。同时,利用IVIS Spectrum小动物活体光学成像系统采集裸鼠皮下成瘤后的荧光图像,并进一步用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测瘤体组织中增殖相关特异性标志物Ki67和PCNA的阳性表达情况。3、利用CSCD、circ BANK、Target Scan、mi RDB、mi RTar Base等生物信息学数据库预测能与环状RNA hsa＿circ＿0006117结合的微小RNA（micro RNA,mi RNA）及相应的靶信使RNA（messenger RNA,m RNA）,使用R（4.0.2）软件进行基因本体论（Go Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,进一步利用基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）筛选在胰腺癌中表达增高并与其预后密切相关且富集在环状RNA hsa＿circ＿0006117可能调控的信号通路上的基因作为候选靶基因。通过RT-q PCR及western blot等实验验证,确定KRAS及mi R-96-5p为环状RNA hsa＿circ＿0006117可能调控的下游靶基因。通过RT-q PCR检测KRAS及mi R-96-5p在胰腺癌组织中的表达并用Pearson相关性检验分析它们的相关性。接下来构建环状RNA hsa＿circ＿0006117野生型（WT）和突变型（MUT）pmi R-RB-Report TM双荧光素酶载体,以及KRAS 3′UTR的野生型（WT）和突变型（MUT）pmi R-RB-Report TM双荧光素酶载体进行双荧光素酶报告基因实验,验证mi R-96-5p是否与它们有直接结合关系。此外,将KRAS-OE质粒或mi R-96-5p inhibitor共转染入环状RNA hsa＿circ＿0006117沉默的胰腺癌PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞中,通过CCK-8、克隆形成、划痕愈合、transwell迁移及侵袭、western blot等进行回复实验,进一步研究环状RNA hsa＿circ＿0006117是否可以通过调控KRAS/MAPK信号通路和吸附mi R-96-5p促进胰腺癌的增殖和迁移侵袭。结果:1、生物信息学分析显示,GSE69362和GSE79634胰腺癌组织芯片中差异表达的环状RNA分别有115个和41个,其中表达上调的分别有81个和15个。Venn图分析表明,环状RNA hsa＿circ＿0006117和hsa＿circ＿0029634同时在两个胰腺癌组织芯片中表达升高。RT-q PCR检测发现,环状RNA hsa＿circ＿0006117在20对胰腺癌组织样本中的相对m RNA表达量较癌旁组织显著升高（t=4.661,P＜0.001）,且与HPDE相比,其在胰腺癌PANC-1,MIA Pa Ca-2,As PC-1,Bx PC-3等细胞系中也呈现高表达（P＜0.001）。应用外扩型引物进行的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果显示,外扩型引物只能在以c DNA为模板时扩增出环状RNA hsa＿circ＿0006117的条带。而扩增条带的Sanger测序结果提示,环状RNA hsa＿circ＿0006117是由PTPRA的第8和第9外显子背向剪切形成的,其剪切位点为CAGATA。同时,RNase R及放线菌素D实验结果显示,环状RNA hsa＿circ＿0006117能够耐受RNase R的消化及不易被放线菌素D降解（P＞0.05）,而线性的PTPRA不能耐受RNase R的消化且容易被放线菌素D降解（P＜0.001）。进一步的RNA核浆分离及FISH实验检测显示,环状RNA hsa＿circ＿0006117主要定位于胰腺癌PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞的细胞质中。最后,绘制ROC曲线提示ROC曲线下面积（Area Under Curve,AUC）为0.810,95%置信区间为0.653-0.967。2、设计的3条si RNA均可以有效干扰环状RNA hsa＿circ＿0006117的表达（P＜0.001）,但不会对其亲本基因PTPRA的表达产生影响（P＞0.05）,其中,circ RNA-si#1和circ RNA-si#2的干扰效率最为显著。将circ RNA-si#1和circ RNA-si#2转染入胰腺癌PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞后的CCK-8及克隆形成实验结果显示,相较于NC组,circ RNA-si#1和circ RNA-si#2组分别抑制了PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞的增殖能力（P＜0.05）。划痕愈合实验、transwell迁移及侵袭实验结果显示,干扰环状RNA hsa＿circ＿0006117抑制了胰腺癌的迁移侵袭能力（P＜0.001）。随后,成功构建稳定干扰环状RNA hsa＿circ＿0006117的慢病毒并进行裸鼠皮下成瘤实验,结果提示与NC对照组相比,circ RNA-sh#1和circ RNA-sh#2明显抑制了胰腺癌的皮下肿瘤形成能力（P＜0.001）,IVIS Spectrum小动物活体光学成像亦显示NC对照组的荧光强度明显强于circ RNA-sh#1和circ RNA-sh#2组。进一步的IHC检测显示,敲低环状RNA hsa＿circ＿0006117后Ki67和PCNA的表达降低（P＜0.001）。3、生物信息学分析提示MAPK和RAS信号通路是环状RNA hsa＿circ＿0006117的下游靶点最可能富集的信号通路,KRAS、GRB2、IGF2BP2和RAP1A等是其最可能调节的靶基因。经过RT-q PCR及western blot检测,最终确定KRAS为环状RNA hsa＿circ＿0006117调控的下游靶基因,二者的相对m RNA表达呈正相关（r=0.5511,P＜0.05）。KRAS-OE质粒共转染的回复实验显示,环状RNA hsa＿circ＿0006117以KRAS依赖的方式,通过促进丝裂原激活的细胞外信号调节激酶1/2（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2,MEK 1/2）和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK 1/2）的磷酸化,激活KRAS/MAPK信号通路,进而促进胰腺癌的增殖和迁移侵袭。同时,通过后续的生物信息学探索、RT-q PCR检测及双荧光素酶报告基因实验,mi R-96-5p被鉴定为环状RNA hsa＿circ＿0006117吸附的mi RNA并在胰腺癌中低表达,其与环状RNA hsa＿circ＿0006117（r=-0.7402,P＜0.001）和KRAS（r=-0.5085,P＜0.05）的表达呈负相关,且可以与环状RNA hsa＿circ＿0006117和KRAS 3′UTR发生直接结合。随后,共转染mi R-96-5p inhibitor的一系列回复实验结果表明,环状RNA hsa＿circ＿0006117可以作为mi R-96-5p的分子海绵,以mi R-96-5p/KRAS依赖的方式促进胰腺癌的增殖和迁移侵袭。结论:1、环状RNA hsa＿circ＿0006117在胰腺癌组织及细胞系中高表达,且主要以闭合环状的形式存在于胰腺癌细胞质中,并具有中等程度的诊断价值。2、环状RNA hsa＿circ＿0006117在体内外促进了胰腺癌增殖,也促进了胰腺癌的迁移侵袭。3、特异高表达的环状RNA hsa＿circ＿0006117通过调控mi R-96-5p/KRAS/MAPK信号通路促进胰腺癌增殖和迁移侵袭,有可能成为胰腺癌有前景的治疗靶点。